火焰樹愈傷組織的誘導方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物培養領域，具體地涉及一種火焰樹愈傷組織的誘導方法。
【背景技術】
[0002] 火焰樹（Spathodea campanulata Beauv)為紫葳科火焰樹屬高大喬木，樹冠傘形、 圓錐形，樹姿婆娑，羽葉茂盛，樹形優美。開花時花多而密集、花大、花色猩紅、花色艷麗，花 開于樹冠之上，有極高的觀賞價值，是良好的風景園林觀賞樹種。原產于熱帶非洲地區。現 在廣泛栽培于印度、斯里蘭卡等，我國廣東、福建、臺灣、云南等地區也均有栽培。火焰樹常 規的繁殖方法主要采用播種、扦插、嫁接等方法。但采用這些方法存在成苗生長周期長、成 型慢、種子發芽率低、出苗率不穩定等問題，無法滿足生產和市場的需求。因此，探索火焰樹 快速繁殖的有效途徑已成為亟待解決的問題。
[0003] 植物組織培養具有繁殖速度快、繁殖系數大、后代整齊一致，能保持原有品種的優 良性狀、可獲得無毒苗、可進行周年工廠化生產、經濟效益高等優點，但植物的組織培養涉 及多方面的因素、影響因子多，形成一套完整的工藝不易。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種火焰樹愈傷組織的誘導方法，以解決現有技術中存在 的上述問題。
[0005] 本發明提供的技術方案如下：
[0006] -種火焰樹愈傷組織的誘導方法，包括如下步驟：
[0007] 1)取火焰樹花瓣在洗衣粉溶液浸泡后流水沖洗，然后轉置超凈工作臺依次用酒 精、升汞、次氯酸鈉滅菌處理，其中用70-80%酒精浸泡25-35s，轉至0. 1~0. 2%HgCl2 5~ 12min后，無菌水漂洗3-5次，再用1 % NaCIO浸泡1~8min后，無菌水漂洗2-4次；每次無 菌水漂洗時間為l_3min ;無菌蒸餾水洗凈后獲得消毒的火焰樹外植體。
[0008] 2)愈傷組織誘導培養：取步驟1)已消毒的外植體切成0. 4-0. 6cm*0. 4-0. 6cm 大小接種于愈傷誘導培養基中，培養條件為：光照強度1200-2000LuX，光照時間8-12h/ d，溫度25±2°C，pH = 5. 8,所述誘導培養基，按每升計算，含有400mg NH4N03、556mg Ca(N03)2*4H20、990mg K2S04、96mg CaCl2*2H20、170mg KH2P04、0.25mg Na2Mo04*2H20、 370mg MgS04 · 7H20、22. 4mg MnS04 · H20、8. 6mg ZnS04 · 7H20、0. 25mg CuS04 · 5H20、27. 8mg FeS04 ·7Η20、37. 3mg Na2MoEDTA、100mg 肌醇、1. Omg 維生素 B1、0. 5mg 煙酸、0. 5mg 維生素 B6、 2.0mg甘氨酸20-30g蔗糖、7-9g瓊脂、誘導培養基中添加0. l-2.0mg2,4-D、0. l-2.0mg NAA、 0. 2mg VC〇
[0009] 3)愈傷組織增殖培養條件為：取步驟2)所得的初代愈傷組織轉接于繼代培 養基中，培養條件為溫度25±2°C，pH = 5. 8,先暗培養0-7d，然后正常光培養，光照強 度1200-2000LuX，光照時間8-12h/d，溫度25 ± 2 °C，所述增殖培養基，按每升計算，含有 200mg NH4N03、668mg Ca(N03)2.4H20、990mg K2S04、170mg KH2P04、0.25mg Na2Mo04.2H20、 370mgMgS04 · 7Η20、22· 4mg MnS04 · Η20、8· 6mg ZnS04 · 7Η20、0· 25mg CuS04 · 5Η20、27· 8mg FeS04 ·7Η20、37· 3mg Na2MoEDTA、100mg 肌醇、L Omg 維生素 B1、0. 5mg 煙酸、(λ 5mg 維生素 B6、 2. Omg甘氨酸、lOOmg水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g瓊脂，增殖培養基中添加 1. 0mg2, 4-D、 0.5-1. Omg NAA^〇-〇. 2mgVC〇
[0010] 其中，步驟1)外植體為火焰樹長勢飽滿未開放花瓣；須經洗衣粉溶液浸泡預處 理。
[0011] 其中，步驟1)中，外植體預處理后優選的滅菌處理方法為洗衣粉溶液浸泡15min， 再流水沖洗2h，之后用75%酒精浸泡30s，轉至0. 2% HgCl28min后，無菌水漂洗4次，再用 1 % NaCIO浸泡8min后，無菌水漂洗3次。該優選處理條件下獲得的外植體成活率最高、同 時污染率和褐化率都很低。
[0012] 其中，步驟2)花瓣愈傷組織誘導培養基優選為：按每升計算，含有400mg ΝΗ4Ν03、 556mg Ca(N03)2 *4H20^990mg K2S04^96mg CaCl2 *2H20^ 170mg KH2P04^0. 25mg Na2Mo04 *2H20^ 370mg MgS04 · 7H20、22. 4mg MnS04 · H20、8. 6mg ZnS04 · 7H20、0. 25mg CuS04 · 5H20、27. 8mg FeS04 ·7Η20、37· 3mg Na2MoEDTA、100mg 肌醇、L Omg 維生素 B1、0. 5mg 煙酸、(λ 5mg 維生素 B6、 2. Omg甘氨酸、20-30g鹿糖、7-9g瓊脂。誘導培養基優選添加 1. 0mg2, 4-D、l. Omg ΝΑΑ、0· 2mg VC 〇
[0013] 其中，步驟3)花瓣愈傷組織增殖培養基優選為：按每升計算，含有200mg ΝΗ4Ν03、 668 mg Ca(N03)2.4H20、990mg K2S04、170mg KH2P04、0.25mg Na2Mo04.2H20、370mgMgS04.7H 20、 22. 4mg MnS04 · H20、8. 6mg ZnS04 · 7H20、0. 25mg CuS04 · 5H20、27. 8mg FeS04 · 7H20、37. 3mg Na2MoEDTA、lOOmg 肌醇、1. Omg 維生素 B1、0. 5mg 煙酸、0· 5mg 維生素 B6、2. Omg 甘氛酸、lOOmg 水解酪蛋白、20-30g蔗糖、7-9g瓊脂、增殖培養基中優選添加1. 0mg2, 4-D、1. Omg NAA、 0. 2mgVC、培養條件為先暗培養7d，然后正常光照培養。
[0014] 本發明以火焰樹的花瓣為外植體，首先采用步驟1)的外植體滅菌方法，獲得成活 率高（可達73. 4% )、褐化率低（6. 8% )、污染率較低（19. 8% )的外植體，再綜合篩選得到 附加不同激素及其濃度配比的花瓣愈傷組織啟動培養及增殖培養基配方，以及光照等多方 面因素，最后可以獲得愈傷組織誘導率可達83. 3 %，增殖率達100%，解決了火焰樹離體培 養中外植體污染率高、愈傷組織誘導率低這一技術難題，為火焰樹組培快繁和品種改良奠 定基礎，本發明方法可以為火焰樹的遺傳轉化及工廠化育苗提供技術支持。
【附圖說明】
[0015] 圖1為花瓣愈傷組織啟動培養實物圖之一；
[0016] 圖2為花瓣愈傷組織啟動培養實物圖之二；
[0017] 圖3為花瓣愈傷組織增殖培養實物圖之一；
[0018] 圖4為花瓣愈傷組織增殖培養實物圖之二；
[0019] 圖5為繼代培養的愈傷組織培養實物圖之一；
[0020] 圖6為繼代培養的愈傷組織培養實物圖之二。
【具體實施方式】
[0021] 以閩南師范大學校園里長勢良好、無病蟲害的火焰樹植株的花瓣為試驗材料。
[0022] 實施例1外植體滅菌
[0023] 選取長勢飽滿未開放的火焰樹花瓣作為外植體。先用市售洗衣粉濃溶液5g/L浸 泡15min后，于流水中沖洗2h，再轉至超凈工作臺，將外植體進行滅菌操作。具體操作見表 1 (HgCl2處理后無菌水漂洗4次，每次2min ;NaC10處理后，無菌水漂洗3次，每次2min)。 滅菌操作完，將花冠切成0. 5cm*0. 5cm大小轉接到相應的培養基上，每處理接種30瓶，每瓶 1-3個材料，重復3次。15d后觀察統計不同外植體的滅菌效果。根據材料的污染率、褐化 率、成活率判斷滅菌方法的優劣。其中，污染率=接種污染數/接種總數X100% ;褐化率 =褐化數/接種總數X 100% ;成活率=無污染、褐化數/接種總數X 100%。
[0024] 表1外植體滅菌處理
[0026] 外植體經過滅菌處理后，接種在相應培養基上，觀察統計其污染率、褐化率、成活 率及生長情況。試驗結果見表2。
[0027] 表2不同消毒處理對外植體滅菌效果的影響
[0029] 由表2可知，火焰樹花瓣滅菌處理中效果最好的是處理7,其成活率最高，達 73. 4%，褐化率為6. 8%，污染率較低，為19. 8 %，愈傷生長良好。其次是處理8,成活率達 66. 2%，但其褐化率為16. 6%，污染率為18. 3%與處理7相差0. 5% ;滅菌效果最差的為處 理1及處理4,其成活率均為10. 1 %。從表1和表2,可看出外植體滅菌處理中，隨著HgCl2濃度的提高、處理時間的延長，污染率隨之下降，但褐化率升高。取(：12與NaCIO組合處理， 滅菌效果比單獨使用好。因此根據結果及外植體生長情況認為火焰樹外植體花瓣的最佳滅 菌方法為：洗衣粉溶液浸泡151^11-流水沖洗211 - 75%酒精3〇8 - 0.1%取(：1281^11-無 菌水漂洗4次一1 % NaCIO 8min -無菌水漂洗3次。
[0030] 實施例2啟動培養
[0031] 本方法以火焰樹花瓣為外植體，進行花瓣愈傷組織誘導培養；
[0032] 以含有以下成分的培養基為誘導培養基：400mg/L NH4N03、556mg/ L Ca(N03)2*4H20、990mg/L K2S04、96mg/L CaCl2*2H20、170mg/L KH2P04、0.25mg/L Na2Mo0