包含氯己定鹽的抗菌微米和納米顆粒及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗微生物微米或納米顆粒（MNP)領域。更具體地，本發明涉及一種包 含氯己定鹽的抗微生物微米或納米顆粒及其制備方法和使用方法；用于控制氯己定釋放的 包含這種抗微生物MNP的醫用制品和復合材料。
【背景技術】
[0002] 氯己定（CHX)是一種公知的使用在各種醫學應用上的抗微生物劑。這些醫學應用 包括皮膚清潔制劑、手消毒劑和含漱液。CHX是一種有益的抗微生物劑，因為它對革蘭氏陽 性菌和革蘭氏陰性菌以及許多酵母菌都有效。相比其他抗微生物劑，氯己定進一步的優勢 是令人滿意的與CHX有關的抗生素耐藥性。盡管個別微生物種群當其經歷遞增的環境濃度 時能夠變得對CHX不再那么敏感，但研究已經表明這種耐藥性是暫時的并且當去除CHX刺 激時該耐藥性會下降。
[0003]CHX的學名為N'，N"" ' -己烷-1，6-二基二[N-(4-氯苯基）（亞氨二羧酸亞氨聯 胺（imidodicarbonimidicdiamide))]，具有下述化學式。
[0005] 最常見的CHX抗微生物劑為易溶鹽CHX二葡萄糖酸鹽的水溶液。也使用稍微不那 么易溶的醋酸CHX(CHXdiacetate，CHA)，有時作為干燥的結晶粉末添加到材料中以便為那 些材料添加一些抗微生物特性。
[0006] 這些CHX化合物的問題在于當以抗微生物組合物使用時，它們僅向靶向區域提供 了含水CHX的非常短暫的釋放。例如，在口服衛生應用中，含漱液中的CHX二葡萄糖酸鹽可 以釋放到口腔中，但幾分鐘內，這一水溶液中的CHX水平嚴重降低。為了向靶向區域持續釋 放足夠水平的抗微生物劑，需要重復該處理。
[0007] 進一步的限制是能夠從處理的基質中釋放的CHX的量（例如每單位表面積的量） 是有限的，并且當所述表面用可溶性CHX鹽的溶液處理時與CHX溶液的濃度有關，因此這些 溶液的抗微生物作用也是有限的、不易于控制的，并且可能是不充分的。
[0008]EP2462960A2公開了一種諸如具有抗微生物劑的導管的醫用留置裝置。該裝置 包括基礎材料和生物活性試劑，所述基礎材料是硅酮-尿烷共聚物，所述生物活性試劑諸 如CHX或其適用的藥用鹽，例如CHA。CHX以取決于特定共聚物組合物的速率從所述基礎材 料中釋放。觀察到了為期14天的CHX緩慢釋放。然而，所述應用僅限于在聚合物導管上的 涂層，因為基礎聚合物是保持CHX所必須的。此外，將CHX釋放提供到甚至更大的程度將是 令人滿意的。
[0009] US2007/0212419A1公開了用于在牙周感染的處理中使用的包含基質凝膠、納米 顆粒（NP)以及CHX的納米復合材料的生物相容性水凝膠（NCHG)。所述NP為由2-甲基丙 烯酸羥乙酯（HEMA)和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA)共聚而制備的聚合物。相同的單 體用于制備交聯的基質。CHX二葡萄糖酸鹽用作活性試劑。NP吸收CHX并觀察到超過200 個小時的緩釋。再一次，這些應用受到所存在的基質凝膠的限制，并且CHX的釋放曲線對于 一些應用仍是不令人滿意的。NCHG不能被用于把抗微生物特性給予現有的醫用制品或組合 物。
[0010] 本發明通過提供包含CHX鹽的抗微生物微米或納米顆粒（MNP)探討了上述問題。 本文提出的一些特別的CHX鹽提供了微溶性MNP，在某些方面，這些CHX鹽在數月的很長期 間內、而不是僅在數天或數周中體現了極好的CHX釋放曲線。在一些實施例中，本文所述的 CHXMNP可以逐漸釋放CHX長達80多天。本文所述的其他CHX鹽具有較短的CHX釋放期， 但能在數小時或數天內釋放非常高劑量的可溶性CHX。在一些方面，CHX從用這些CHX鹽的 MNP處理的樣品中的釋放要比從只用CHX溶液處理的樣品中獲得的釋放更快，且釋放量更 大。這些快速釋放方面在去污染應用中、或者處理特別頑固的或急性的感染或發作中可能 是有用的。此外，MNP可以使用在各種各樣的應用中，例如涂在醫用制品上或嵌入到醫用制 品內以給予附加的抗微生物特性，或者作為復合材料的組分，所述復合材料能夠用于通過 使可溶性CHX從抗微生物MNP中逐漸浸出的方式在很長一段時間內向靶向區域釋放穩定劑 量的抗微生物CHX，或者能夠用于比從CHX溶液處理的樣品中釋放CHX更快地釋放更高劑量 的CHX。此外，本發明的MNP還可以顯示遲釋釋放曲線或者通過改變環境條件而引發的CHX 的釋放曲線。
【發明內容】
[0011] 在某些方面，本發明提供了包含CHX鹽的抗微生物微米或納米顆粒。特別地，本發 明提供了包含CHX鹽的抗微生物微米或納米顆粒，其中所述鹽的陰離子選自磷、碳、氮和硫 的含氧酸陰離子及部分氫化的磷、碳、氮和硫的含氧酸陰離子。優選地，所述陰離子選自磷、 碳、氮和硫的含氧酸陰離子，更優選地，所述陰離子選自磷酸根、碳酸根、硝酸根或硫酸根中 的至少一種。更優選地，所述陰離子選自：磷酸根，所述磷酸根選自以焦磷酸根為起始的聚 磷酸根的同源系列和以三偏磷酸根為起始的環狀偏磷酸根的同源系列；以及氮和硫的含氧 酸陰離子及部分氫化的氮和硫的含氧酸陰離子。更優選地，所述陰離子選自從以焦磷酸根 為起始的聚磷酸根的同源系列和以三偏磷酸根為起始的環狀偏磷酸根的同源系列中選擇 的磷酸根。更優選地，所述陰離子選自以三偏磷酸根為起始的環狀偏磷酸根的同源系列，尤 其是六偏磷酸根。
[0012] 在優選方面，MNP是納米尺寸，即該結構具有從lnm到1ym范圍內的至少一個尺 寸。
[0013] 本發明還提供了如本文所述的抗微生物MNP的膠體懸浮液。
[0014] 本申請還提供了包含如本文所述的抗微生物MNP的醫用制品和包含如本文所述 的抗微生物MNP的復合材料。
[0015] 本發明還考慮了如本文所述的抗微生物MNP的制備方法和使用方法。
[0016] "抗微生物劑"是指一種作用為殺死微生物或至少抑制其生長的物質。術語"微生 物"用于描述諸如細菌、古生菌和/或真菌的微觀可見的生物體。因此，本文的抗微生物化 合物和組合物可以殺死這些微觀可見的生物體，或者至少抑制它們的生長。
[0017] 本文所使用的術語"磷酸根"是指任何基于磷和氧的陰離子。磷酸根通常由四配 位的正磷酸根自由基構成。磷酸根可以為直線型的、支鏈的或環狀的。典型的磷酸根包括 以正磷酸根和焦磷酸根為起始的線型磷酸根和聚磷酸根的同源系列、以及以三偏磷酸根為 起始的環狀偏磷酸根的同源系列的磷酸根。有機磷酸根也包括在這一定義內。典型的有機 磷酸根包括烷基磷酸根，例如C1-6烷基磷酸根。
[0018] "微米或納米顆粒"是指尺寸在大約lnm到100 ym之間的顆粒。
[0019] 在本發明說明中，"微米或納米顆粒"也意圖包括其他適用的微米或納米結構，例 如管（單壁或多壁）、絲盤、棒、錐體、"刺猬"形、晶體（例如細長晶體）和無定形形式。這樣 的結構展示了至少一個空間尺寸為從大約lnm到100ym，優選從lnm到10ym，優選從lnm 到小于1ym(即"納米結構"或"納米規模"尺寸），更優選從5nm到500nm，更優選從20nm 到200nm，甚至更優選從20nm到140nm。所述結構的所有三維尺寸也可以都落到這一尺寸 范圍內。
【附圖說明】
[0020] 注釋：對每個電鏡（SEM)在方括號內給出了比例尺大小和圖像放大率。
[0021] 圖1示出了硼硅酸鹽玻璃玻片在浸漬到下述組合物后的SEM顯微圖像。（a) 水或含水CHX(25yM和 5mM) [220ym，540X];(b) 5/5CHX-正磷酸根[10ym，6200X]; (c) 5/5CHX-焦磷酸根[20ym，5350X] ; (d) 5/5CHX-三磷酸根[20ym，5150X]。
[0022] 圖2示出了硼硅酸鹽玻璃玻片在浸漬到下述組合物后的SEM顯微圖像。 (e)5/5CHX-HMP[10ym，6500X] ;(f)5/5CHX-硝酸根[10ym，6400X] ;(g)5/5CHX-碳酸根 [10ym,7800X]〇
[0023] 圖3示出了正磷酸鹽、焦磷酸鹽和三磷酸鹽樣品的CHX洗脫圖。
[0024] 圖4示出了硝酸鹽和碳酸鹽樣品、連同分別暴露于25yM和5mM的CHX溶液的對 照樣品的CHX洗脫圖。
[0025] 圖5示出了海藻酸鹽創傷敷料的下述SEM顯微圖像。（a)對照樣品，無MNP[60ym， 2000X]; (b)CHX-HMP-0. 5MNP[10ym，10400X]; (c)CHX-HMP-5MNP[10ym，10000X]。
[0026] 圖6示出了硼硅酸鹽玻璃玻片的下述SEM顯微圖像。（a)對照樣品，無MNP[60ym， 1980X]; (b)CHX-HMP-0. 5MNP[10ym，9900X]; (c)CHX-HMP-5MNP[10ym，10000X]。
[0027] 圖7示出了乙烯乙酸乙烯酯（EVA)聚合物的下述SEM顯微圖像，其中一些乙 烯乙酸乙烯酯（EVA)聚合物包含有MNP。（a)對照樣品，無MNP[10ym，9900X] ;(b) CHX-HMP-0. 5MNP[10ym，9800X];(c)CHX-HMP-5MNP[10ym，10200X]。
[0028] 圖8示出了鈦表面的下述SEM顯微圖像，其中一些鈦表面已用MNP處理。 (a)對照樣品，無MNP[50ym，2080X] ;(b)CHX-HMP-〇. 5MNP[10ym，10000X] ;(c) CHX-HMP-5MNP[10ym,10000X]〇
[0029] 圖9示出了下述鈦表面的原子力顯微鏡（AFM)圖像（水平尺寸1 ym，垂直尺 寸55nm)，其中一些鈦表面已用MNP處理。（a)拋光的Ti表面；(b)CHX-HMP-O. 5MNP; (c) CHX-HMP-5MNP〇
[0030] 圖10示出了下述玻璃表面的AFM圖像（水平尺寸1ym，垂直尺寸60nm)，其中一些 玻璃表面已用MNP處理。（a)清潔的未處理的玻璃；(b)CHX-HMP-O. 5MNP; (c)CHX-HMP-5MNP。
[0031] 圖11示出了下述云母（超平）表面的AFM圖像（水平尺寸1um，垂直尺寸20nm)， 其中一些云母已用MNP處理。（a)清潔的未處理的玻璃；(b)CHX-HMP-O. 5MNP。
[0032]圖12示出了用對照溶液（25yMCHX)、CHX-HMP-0. 5和CHX-HMP-5處理的海藻酸 鹽敷料的CHX洗脫圖。
[0033]圖13示出了用對照溶液（25yMCHX)、CHX-HMP-0. 5和CHX-HMP-5處理的玻璃的 CHX洗脫圖。
[0034]圖 14 示出了用對照溶液（25yMCHX)、CHX-HMP-0. 5 和CHX-HMP-5 處理的EVA聚 合物的CHX洗脫圖。
[0035] 圖15示出了用對照溶液（25yMCHX)、CHX-HMP-〇. 5和CHX-HMP-5處理的鈦的CHX 洗脫圖。
[0036] 圖16示出了用不同水平的CHX-HMP-MNP處理的各玻璃離子體水門汀（GIC)的累 積CHX釋放圖。
[0037] 圖17示出了用不同水平的CHX-HMP-MNP處理的各GIC樣品的累積氟化物釋放。
[0038] 圖18示出了顯示GIC樣品的斷裂表面的下述SEM顯微圖像。（a)未改性的 GIC[20ym,5000X]；(b)lwt%MNP[20ym，5050X] ; (c) 2wt%MNP[20ym, 5000X]； (d)5wt%MNP[20ym, 5000X] ； (e)lOwt%MNP[20ym, 5000X] ； (f) 20wt%MNP[20yM, 5050X]〇
[0039] 圖19示出了對抗MRSA的CHX和CHX-HMP-5在620nm下的光密度（0D)測量值。從 這些測量值可以計算最小抑制濃度。深灰色條：25yMCHX;淺灰色條：CHX-HMP-5。
[0040] 圖20示出了對抗銅綠假單胞菌（P.aeruginosa)的CHX和CHX-HMP-5在620nm下 的光密度（0D)測量值。從這些測量值可以計算最小抑制濃度。深灰色條：25yMCHX;淺灰 色條：CHX-HMP-5。
[0041] 圖21示出了用CHX或CHX-HMP-5對抗MRSA處理后在595nm下的光密度（0D)測 量值。從這些測量值可以判定生物膜的抑制。深灰色條：25yMCHX;淺灰色條：CHX-HMP-5。
[0042] 圖22示出了用CHX或CHX-HMP-5對抗銅綠假單胞菌處理后在595nm下的光密 度（0D)測量值。從這些測量值可以判定生物膜的抑制。深灰色條：25yMCHX;淺灰色條： CHX-HMP-5〇
[0043] 圖23示出了CHX-HMP-0. 5NP(上）和CHX-HMP-5NP(下）的透射電子顯微鏡（TEM) 顯微圖像。箭頭指示了單獨NP的例子。比例尺= 500nm。
[0044] 圖24示出了顯示CHX-HMP-5 (上）和CHX-HMP-0. 5 (下）的尺寸分布的動態光散 射（DLS)數據。這三組數據指出了每個濃度處一式三份所制成的測量值。
[0045] 圖25示出了顯示CHX-HMP-5 (上）和CHX-HMP-0. 5NP(下）的電荷分布的G-電 勢數據。這三組數據指出了每個濃度處一式三份所制成的測量值。
[0046] 圖26示出了包含特定量的CHX-HMP-5NP的CMC薄膜（每m255gCMC)的CHX洗脫 圖。方塊表示CMCMw為700kDa且6wt%的NP;三角形表示CMCMw為250kDa且6wt%的 NP;十字形表示CMCMw為700kDa且3wt%的NP;菱形表示CMCMw為250kDa且3wt%的 NP;圓圈表示CMCMw為250kDa且Owt%的NP。
[0047]圖27示出了包含特定量的CHX-HMP-5MNP的海藻酸鹽薄膜的CHX洗脫圖。方塊表 示6wt%的MNP;菱形表示3wt%的MNP。
[0048] 圖28示出了以1次浸涂涂覆有CHX-HMP-5NP的聚氨酯（菱形）和用25yM的CHX 水溶液處理的聚氨酯（橫杠）的CHX洗脫圖。
[0049] 圖29示出了顯示使用5次浸涂法[50ym，2000X](左）和10次浸涂法[50ym， 2020X](右）涂覆有CHX-HMP-5的聚氨酯的SEM顯微圖像。右側區域示出了NP沉積。
[0050] 圖30示出了在聚氨酯基質上生長的4種微生物的活-死染色圖像：（從左到右） 用無MNP(未處理）、CHX-HMP-5MNP和CHX-HMP-50MNP處理的（從上到下）MRSA、大腸桿菌、 銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌（K.pneumonia)。
[0051] 圖31示出了對于本體⑶硅酮（上）以及密封劑⑶硅酮（下）以1分鐘（菱 形）、30分鐘（方塊）、2小時（三角形）或6小時（圓圈）的浸涂時間涂覆有CHX-HMP-5NP 和涂覆有對照CHX溶液（折線）的各硅酮的CHX釋放。在第8周更新介質以解釋任何飽和 度。
[0052] 圖32示出了對于本體（body)⑶硅酮（上）以及密封劑（S)硅酮（下）以1分鐘 (菱形）、30分鐘（方塊）、2小時（三角形）或6小時（圓圈）的浸涂時間涂覆有CHX-TP-5NP 及涂覆有對照CHX溶液（折線）的硅酮的CHX釋放。在第8周更新介質以解釋任意飽和度。
[0053] 圖33示出了對于本體⑶硅酮（上）以及密封劑⑶硅酮（下）以1分鐘（菱 形）、30分鐘（方塊）、2小時（三角形）或6小時（圓圈）的浸涂時間涂覆有CHX-TMP-5NP 及涂覆有對照CHX溶液（折線）的硅酮的CHX釋放。在第8周更新介質以解釋任意飽和度。
[0054] 圖34示出了具有CHX-HMP-5NP涂層（左側，