一種培養后的nk細胞的凍存液及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及細胞凍存液技術領域，具體設及一種培養后的NK細胞的凍存液及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 細胞凍存是長期保存維持細胞活性的一種有效方法，其凍存經過低溫冷凍保存和 超低溫冷凍保存兩個階段，低溫冷凍保存可W降低細胞的代謝，而超低溫（-198°C的液氮 中）冷凍保存可W保存活細胞物質代謝和幾乎完全停止細胞生長，在超低溫凍存是，調節 和控制細胞生長代謝的各種酶的活性受到抑制，使細胞內的生化反應十分緩慢，甚至停止， 從而保持了細胞的活性。
[0003] 但是如果單純的凍存，在凍存過程中細胞會受到兩個方面的損傷：第一，在凍存的 過程中，胞外的水分首先結冰，使得未結冰的溶液中電解質濃度升高，造成細胞死亡，屬于 滲透性損傷；第二，由于低溫導致細胞胞內部形成冰晶會破壞細胞內的結構，屬于機械損 傷。因此結合W上兩點原因，必須解決冷凍的速度，及凍存劑的配方，復蘇時融凍的速度也 直接影響細胞的活性。
[0004] 細胞凍存液是指用于保護細胞免受冷凍損失的物質，一般可分為滲透性和非滲透 性兩類。滲透性凍存液主要是小分子物質，易溶于水，與水分子結合能力強，容易通過細胞 膜進入細胞內，降低細胞的冰點，提高細胞膜對水的通透性，減少冰晶形成，從而減小冰晶 的損傷。 陽0化]近幾年NK細胞對治療癌癥等疾病的研究及應用較為廣泛，NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒， 顆粒的含量與NK細胞的殺傷活性呈正相關。其占循環中淋己細胞族群的5-10%，可W分泌 穿孔素及腫瘤壞死因子，摧毀目標細胞，有重要的治療意義，因此，NK細胞通過凍存保存其 活性和功能也尤為重要。為了避免長時間的培養而增加的成本、培養時間超過最佳對數生 長期后細胞的生長狀態及活性的下降而影響細胞的治療質量和患者多次采血而增加的傷 痛等問題，保存培養后的NK細胞也成了必要的方法之一，也因此保存的凍存液也直接影響 到了細胞凍存的質量，最主要的是細胞凍存后復蘇的活率，運樣還可W將健康狀態下的NK 細胞保存起來，W防將來不時之需。
[0006] 現有技術主要是采取胎牛血清（FB巧、二甲基亞諷值MS0)和RPMI-1640培養基按 不同比例配制凍存液來進行NK細胞培養后的保存，或是采用自體血清代替胎牛血清進行 凍存。雖然前一種方法保存細胞的時間長，但是采用胎牛血清配制的凍存液，就引入了外源 蛋白，增加了病原污染的風險。采用自體血清代替胎牛血清能夠完全杜絕外源污染物感染 的風險，但是凍存后復蘇培養的NK細胞活性低。
【發明內容】
[0007] 本發明針對現有技術中存在的問題，提供一種臨床安全性高，同時又能很好的保 持凍存細胞活性的細胞凍存液，用于凍存培養后的NK細胞。
[0008] 本發明還提供一種培養后的NK細胞的凍存液的制備方法。
[0009] 本發明通過W下技術方案實現該目的：
[0010] 一種培養后的NK細胞的凍存液，所述凍存液由溶液A和自體血清配制而成，溶液 A和自體血清的體積比為1 :0. 5~2,其中： 陽0川溶液A由自體血清混合液與DMS0配制而成，自體血清混合液與DMS0的體積比為 3 ~6 :1 ;
[0012] 自體血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，該細胞的凍存 液中茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為0. 5~5mg/ml、0. 125~0. 5mg/ml、 0. 5 ~5m邑/ml。
[0013] 作為優選的，所述凍存液由溶液A和自體血清配制而成，溶液A和自體血清的體積 比為1 :0. 5~1，其中：
[0014] 溶液A由自體血清混合液與DMS0配制而成，自體血清混合液與DMS0的體積比為 3 ~5 :1 ;
[0015] 自體血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，該細胞的 凍存液中茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為0. 5~2. 75mg/ml、0. 125~ 0. 3125mg/ml、0. 5 ~2. 75mg/ml。
[0016] 作為另一優選的，所述凍存液由溶液A和自體血清配制而成，溶液A和自體血清的 體積比為1:1~2,其中：
[0017] 溶液A由自體血清混合液與DMS0配制而成，自體血清混合液與DMS0的體積比為 5 ~6 ： 1 ;
[0018] 自體血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，該自體血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為2. 75~5mg/ml、0. 3125~0. 5mg/ ml、2.75 ~5mg/ml。
[0019] 一種培養后的NK細胞的凍存液的制備方法，包括W下步驟：
[0020] 1)自體血清混合液的配制：分別稱取適量茶多酪、葡萄巧提取物和維生素C加入 自體血清中，制得自體血清混合液；
[002U。溶液A的配制：向步驟1)中制得的自體血清混合液中緩慢加入DMS0,自體血清 混合液與DMS0的體積比為3~6 :1，制得溶液A，置于2~8°C度冰箱預冷，備用； 陽022] 3)將預冷后的溶液A取出，緩慢加入到自體血清中，溶液A和自體血清的體積比 為1 :0. 5~2,制得凍存液，其中，茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為0. 5~ 5mg/ml、0. 125 ~0. 5mg/ml、0. 5 ~5mg/ml。
[002引相對于現有技術，本發明的有益效果為：本發明的培養后的NK細胞的凍存液包含 茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，由于其采用自體血清，不存在外源動物病毒 的污染及外源蛋白質的引入，安全性高；其中加入的茶多酪、葡萄巧提取物（原花青素）、維 生素C不僅能有效的抑制細胞氧化，保持細胞的活性，對人體無任何傷害，而且凍存復蘇后 細胞的狀態基本接近凍存前的狀態，凍存效果好。
【附圖說明】
[0024] 圖1為凍存前的NK細胞形態圖。
[002引圖2為凍存后的實驗組1的NK細胞形態圖。
[0026] 圖3為凍存后的實驗組2的NK細胞形態圖。
[0027] 圖4為凍存后的實驗組3的NK細胞形態圖。
[0028] 圖5為凍存后的對照組的NK細胞形態圖。
[0029] 圖6為凍存前后的NK細胞殺傷活性曲線圖。
【具體實施方式】
[0030] W下結合附圖及具體實施例對本發明進行詳細描述。 陽0川 實施例1、
[0032] 本實施例提供一種培養后的NK細胞的凍存液的制備方法，包括W下步驟：
[0033] 1)自體血清混合液的配制：分別稱取適量茶多酪、葡萄巧提取物和維生素C加入 自體血清中，制得自體血清混合液；
[0034]。溶液A的配制：向步驟1)中制得的自體血清混合液中緩慢加入DMS0,自體血清 混合液與DMS0的體積比為3~6 :1，制得溶液A，置于2~8°C度冰箱預冷，備用；
[0035] 3)將預冷后的溶液A取出，緩慢加入到自體血清中，溶液A和自體血清的體積比 為1 :0. 5~2,制得凍存液，其中，茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為0. 5~ 5mg/ml、0. 125 ~0. 5mg/ml、0. 5 ~5mg/ml。
[0036] 實施例2、
[0037] 本實施例按照實施例1所述的方法制備培養后的NK細胞的凍存液，由溶液A和自 體血清配制而成，溶液A和自體血清的體積比為1 :0. 5,其中： 陽03引溶液A由自體血清混合液與DMS0配制而成，自體血清混合液與DMS0的體積比為 3:1；
[0039]自體血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，該自體血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為0. 5mg/ml、0. 125mg/ml、0. 5mg/ml。 W40] 實施例3、
[0041]本實施例按照實施例1所述的方法制備培養后的NK細胞的凍存液，由溶液A和自 體血清配制而成，溶液A和自體血清的體積比為1 :2，其中： 陽0創溶液A由自體血清混合液與DMS0配制而成，自體血清混合液與DMS0的體積比為6:1;
[0043]自體血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，該自體血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為5mg/ml、0. 5mg/ml、5mg/ml。 W44] 實施例4、
[0045] 本實施例按照實施例1所述的方法制備培養后的NK細胞的凍存液，由溶液A和自 體血清配制而成，溶液A和自體血清的體積比為1 :1，其中： 陽046] 溶液A由自體血清混合液與DMS0配制而成，自體血清混合液與DMS0的體積比為 4. 5 :1 ;
[0047]自體血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C和自體血清，該自體血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、維生素C的終濃度分別為2. 75mg/ml、0. 3125mg/ml、2. 75mg/ mlo
[0048] 對比例1、
[0049] 本對比例配制常規細胞凍存液，所述常規細胞凍存液為含有10%DMSO的FBS。
[0050] 實施例5、N