美國野豌豆高頻再生體系建立的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業栽培生物技術領域，特別涉及一種美國野豌豆高頻再生體系建立的方法。
【背景技術】
[0002]美國野豌豆(Vicia sepium Linn)，植物界，雙子葉植物綱，豆科，多年生草本，多花，是一種良好的蜜源植物，以全草入藥。夏季采，曬干或鮮用。根可以生吃，煮熟后味道更好。種子含油。葉及花果藥用有清熱、消炎解毒之效。植株秀美、花色艷麗，可作觀賞花卉。現蕾期出現較早，這時分枝甚少，莖枝低矮、細嫩柔軟，其營養成分粗蛋白質高達26.9%，而此時產草量也高。開春以后，隨著氣溫升高，植株開始迅猛生長，4月14日進入結莢期，植株高達83.5cm，莖葉雖尚為綠色，這時叩割產草量高，但營養成分卻降低了，粗纖維增加，粗蛋白質則降低為18.55%。從植株分枝情況來看，秋播時在結實期的分枝數可達30 - 40個，而春播時在結莢期分枝僅20個左右。因而最適宜收刈時期應在結莢期，從收刈時期來看也較同屬植物早20天左右，這在南方水稻區推廣，對緩解前后茬矛盾上是很有利的。在我國南方旱作區推廣尚可解決收種和牧草的矛盾；因此，野豌豆可望培育成南方農田推廣的綠肥新品種。野豌豆莖葉含鈣、磷比較豐富，用作青飼、青貯和調制干草。美國野豌豆的種植既可以滿足生態環境建設的需要，更是促進畜牧業可持續發展的重要措施。
[0003]植物的高頻再生體系是以植物幼莖扦插技術為主要手段，在整個體系上需要保證再生體系的培養能夠完整實施，主要的技術手段一是選擇恰當植物外植體材料，二是對各階段培養基生根組分的選擇與優化。
[0004]專利號為CN102144559A的專利公布了一種扁穗牛鞭草高頻再生體系建立方法，以扁穗牛鞭草幼莖或幼葉為外植體建立高頻再生體系，依照愈傷組織誘導、愈傷組織繼代培養、愈傷組織分化培養、再生苗增殖培養、再生苗生根培養、再生苗煉苗移栽的操作流程建立扁穗牛鞭草高頻再生體系。
[0005]專利號為CN103947548A的專利公布了一種百子蓮高頻再生體系建立的方法，以百子蓮幼小花蕾為外植體建立高頻再生體系。
[0006]雖然目前已有植物愈高頻再生體系研究的報道，但目前關于美國野豌豆高頻再生體系建立的方法還未有研究和專利公布。
【發明內容】
[0007]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種美國野豌豆(Vicia sepium Linn)高頻再生體系建立的方法，該方法重復性好、再生率高，不僅可以迅速地獲得大量優質的美國野豌豆，還可以為以后用作生物技術和基因工程方法對植物進行遺傳改良。美國野豌豆的種植也可以滿足生態環境建設的需要，更是促進畜牧業可持續發展的重要措施。為實現上述目的，本發明的技術方案如下:
[0008]美國野豌豆高頻再生體系建立的方法，包括以下步驟:
[0009]I)外植體的選取與處理:選取美國野豌豆的幼莖為外植體，消毒后蘸取愈傷培養基SI ;
[0010]2)生根培養:將步驟I)處理后的外植體轉入生根培養基S2中處理20-26小時；
[0011]3)生苗生根培養:將步驟2)處理后的外植體插入生苗生根培養基S3浸拌處理的濕沙基質中，置于20-25°C恒溫條件育苗，得到幼苗。
[0012]外植體選取材料幾乎包括了植物體的各個部位，如莖尖、莖段、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。不同種類的植物以及同種植物不同的器官對誘導條件的反應是不一致的。選取材料時要對所培養植物各部位的誘導及分化能力進行比較，從中篩選出合適的、最易表達全能性的部位作為植體。本發明選取性美國野豌豆的幼莖為外植體，其生長速度快，繁殖率高，不容易發生變異，是獲得脫毒苗木的有效途徑。
[0013]進一步，步驟I)所述消毒的處理的試劑包括75%的酒精和0.1%的氯化汞，所述外植體在中0.1 %的氯化汞中消毒時間為4-7分鐘。
[0014]作為一種優選，將所述外植體置于75%的酒精中滅菌20-35秒，取出后用無菌水沖洗3次，再浸于0.1 %的氯化汞中滅菌4-7分鐘，取出后用無菌水沖洗4-6次。不同消毒方法對外植體的影響不同，0.1%的氯化汞消毒效果隨滅菌時間的增加而加強，外植體消毒1min污染率為0，消毒7min外植體出現枯死，消毒1min枯死數量明顯增加。所以本發明外植體在中0.1 %的氯化汞中消毒時間為4-7分鐘效果較好。
[0015]進一步，步驟I)所述愈傷培養基SI包含蜂蜜原液。蜂蜜原液由于含有高濃度葡萄糖和果糖等單糖，具有較高的滲透壓，可防止植株傷口流失水分，促進傷口愈合的作用。
[0016]進一步，步驟2)所述生根培養基S2包含100-1000mg/L的α -萘乙酸鈉和100-1000mg/L吲哚丁酸鉀的水溶液，pH為5_9。
[0017]a_萘乙酸鈉為生長素類植物生長調節劑，是光譜性的植物生長調節劑，促進細胞分裂和組織分化，用于果實膨大及塊根塊莖的膨大。誘導根和不定根的形成，用于加快扦插枝條生根和種子發根。還可以用于保花保果，提高產量，增強抗逆能力等，是一種廣譜、高效、低毒的植物生長調理劑。吲哚丁酸鉀是一種促生根類植物生長調節劑，主要用于插條生根劑，誘導作物形成不定根，具有長效性與專一性的特點，并集中在生長點部位，促進細胞分裂，誘導形成不定根，表現為根多，根直，根粗，根毛多。易溶于水，活性比吲哚乙酸高，穩定性好，使用安全。
[0018]進一步，步驟2)所述生根培養基S2包含100_600mg/L的α -萘乙酸鈉和100-600mg/L吲哚丁酸鉀的水溶液，pH為5-9。
[0019]進一步，步驟3)所述生苗生根培養基S3包含100-1000mg/L的α-萘乙酸鈉、100-1000mg/L吲噪丁酸鉀和100-1000mg/L磷酸二氫鉀的水溶液，pH為5-9。
[0020]磷酸二氫鉀是一種培養劑，可用于配制培養基，植物生長需要磷和鉀，磷酸二氫鉀做為緩沖劑，在培養基中可提供增加K和P元素。培養基中含有外植體生長所需要的營養物質，是組織培養中外植體賴以生存和發展的基礎。外在組織培養的各個階段，基本培養基都是最重要的因素，因此選擇合適的培養基是組織培養成功與否的關鍵因素。
[0021]進一步，步驟3)中所述外植體插入基質中的lcm。
[0022]進一步，步驟3)所述育苗的日光照度為2000-30001x，時間為16-22天，16小時/天。
[0023]進一步，美國野豌豆高頻再生體系建立的方法，還包括步驟:
[0024]4)將步驟3)所述幼苗進行煉苗培養和移栽。
[0025]進一步，所述煉苗培養的時間為5-15天，所述移栽基質為沙土。
[0026]本發明的有益效果在于:本發明提供了一種美國野豌豆高頻再生體系建立的方法，所建立的美國野豌豆高頻再生體系具有更良好的技術效果，具有生長繁殖快、重復性高、操作簡單、條件易于控制等特點。在優選條件下，上述方法可以通過對各培養階段中培養基組分的優化提高美國野豌豆高頻再生體系在各階段的產出率與產物品質。試驗數據顯示，蘸取SI培養基，再在S2培養基上處理24小時后，插入以S3培養基浸拌處理的濕沙基質中1CM，置于20-25°C恒溫條件育苗，10天后生根率可達100%，移栽成活率也可達100%。不僅可以迅速地獲得大量優質的美國野豌豆，還可以為以后用作生物技術和基因工程方法對植物進行遺傳改良。美國野豌豆的種植也可以滿足生態環境建設的需要，更是促進畜牧業可持續發展的重要措施。
【附圖說明】
[0027]圖1為用本發明方法建立再生體系系統移栽后的美國野豌豆示意圖。
【具體實施方式】
[0028]以下將結合附圖，對本發明作詳細的說明。為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。所舉實施例是為了更好地對本發明的內容進行說明，但并不是本發明的內容僅限于所舉實施例。所以，熟悉本領域的技術人員根據上述
【發明內容】
對實施方案進行非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
[0029]美國野豌豆高頻再生體系的建立
[0030]材料
[0031](I)植物外植體材料:以美國野豌豆的幼莖為外植體材料。
[0032](2)主要試劑:
[0033]取α-萘乙酸鈉0.1-1g和吲哚丁酸鉀0.l_lg，用少量無水乙醇溶解后，加蒸餾水配成lmg/L的母液，于4°