一種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法。
【背景技術】
[0002] 國槐（SophorajaponicaL.)在分類上屬于蝶形花科（Papilionaceae)槐屬 (Sophora)，又叫槐樹、家槐等，耐輕度鹽堿、耐寒、耐旱，對空氣中的二氧化硫、氯氣、氯化 氫及煙塵等環境污染有較強的抗性和適應性，是一種集藥用、材用、食用、觀賞與一身的高 效生態及經濟樹種，在我國廣泛分布。
[0003] 國槐種子因種皮有細胞緊密結合的柵欄層，透水性差，干藏的種子常規播種出苗 困難，發芽率低，常需要進行催芽處理，前人已對國槐種子的催芽方法進行了許多嘗試性研 究，取得了很好的效果，總體上可將這些催化方法歸為2類：沙藏催芽和熱水浸種。
[0004] 熱水浸種：種子處理時，將種子放人缸內，用80°C的熱水浸種，邊倒水邊攪拌至水 不燙手為止。浸泡一晝夜后，將吸水膨脹的種子撈至草簾上攤平，并用濕草簾覆蓋，以保溫 保濕，放在背風向陽處進行催芽。
[0005] 沙藏催芽：把種子和沙子（濕度80% )拌均勻，放到背蔭處，進行沙化休眠，溫度 在〇°C左右，以不成冰坨為宜，五十天左右就可上溫床催芽。
[0006] 另外，目前還有采用濃硫酸破傷種皮并結合低溫沙藏進行催芽，可以提高種子萌 發率，但濃硫酸在燒傷種皮的同時也增加了外界細菌進入種子內部的風險，容易造成種子 污染幾率的增大。
[0007] 剛剛萌動狀態的胚根是國槐組培再生及基因轉化的良好外植體，而在實驗操作過 程中很難快速獲得狀態一致的剛剛萌動的胚根。上述方法在實際操作中取得了很大的成 功，但沙藏催芽需要時間太長，而熱水浸種時種子萌發一致情況差，不適合在國槐組培中應 用。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法。
[0009] 本發明采用以下技術方案：
[0010] -種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)種子的挑選：挑選成熟飽滿的種子；
[0012] (2)種子的消毒：將種子采用乙醇溶液消毒30~60s，然后采用HgCljPTriton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）的混合溶液浸泡10~14min，浸泡之后采用無菌水沖洗，其 中HgCljPTritonX-100的質量分數均為0? 08~0? 1%;
[0013] (3)接種：滅菌后的種子吸干水后放置在裝有無菌水的無菌容器中；
[0014] (4)培養：將裝有種子的無菌容器放置在搖床上暗培，溫度22~28°C。
[0015] 步驟⑴中，所述種子的保存時間不超過1年，根據種子的生理變化特性以及大量 實驗驗證，選擇保存時間1年內的種子的萌發率較高。
[0016]步驟（2)中，所述乙醇溶液的體積分數為70~75%，當乙醇的體積分數超過75% 時，使蛋白質凝固的作用越強，當高濃度的乙醇與細菌接觸時，就能使得菌體表面迅速凝 固，形成一層薄膜，阻止了酒精繼續向菌體內部滲透，細菌內部的細胞沒能徹底殺死，待到 適當時機，薄膜內的細胞可能將薄膜沖破而重新復活，因此使用超過75%乙醇并不能達到 很好的消毒殺菌的目的；經大量實驗驗證與分析，若低于70%，消毒殺菌效果不理想。如果 使用70~75%的乙醇溶液，既能使組成細菌的蛋白質凝固，又不能形成薄，能使乙醇繼續 向內部滲透，而使其更加徹底消毒殺菌。
[0017]優選的，所述乙醇消毒時間為40s，乙醇對國槐種子的殺傷作用很大，時間過長的 話，國槐種子的生長將會受到影響，當消毒時間控制在30~60s，尤其是40s時，乙醇能發揮 其應有的效果。
[0018] 優選的，混合溶液的浸泡時間為12min，消毒藥劑的浸泡時間對國槐種子的萌發 情況影響較大，浸泡時間較短種子污染情況嚴重，時間較長的話，對種子的生長器官損害較 大，種子的萌發率較低。
[0019] 優選的，所述HgCljPITritonX-100的質量分數均為0? 1 %。由于HgCl2和Triton X-100對種子的萌發情況影響較大，需要選擇合適的藥劑濃度，經過大量實驗驗證與分析， 選擇上述藥劑濃度使得國槐種子的萌發情況、污染情況和長勢情況較佳。
[0020] 步驟（3)中，優選的，所述無菌容器中的水深剛沒過種子，經過大量實驗驗證與分 析，種子的培養效果較好。
[0021] 步驟⑷中，優選的，所述溫度為25°C，搖床轉速為70~90轉/min，進一步優選 的，搖床轉速為80轉/min。適當的搖床轉速主要是保證了種子在萌發過程中充分的有氧 呼吸，暗培是為了獲得適合組培的外植體，當有光照培養時，光會使細胞分化，分化的細胞 不在增殖，光照下獲得的胚根外植體再生效果差。在適宜的培養溫度下呼吸作用會逐漸加 快，酶的活性逐漸加強，代謝活動逐漸旺盛，萌發率提高，經過大量實驗驗證與分析，選擇溫 度為22~28°C，搖床轉速70~90轉/min，優選25°C，搖床轉速80轉/min。
[0022] 本發明的有益效果是：
[0023] (1)胚根是國槐再生中效率最高的一種外植體，獲得方便，且不受季節限制，本發 明提供一種快速、高效獲得胚根的方法，在一定程度上縮短國槐再生所需時間，僅僅3天后 國槐種皮漲破，胚根露出，此時的胚根可直接應用在國槐再生。3天后的萌發率高達49 %，9 天后萌發率高達76. 2%，且長勢一致，污染率極低。
[0024] (2)本發明首先采用乙醇對國槐種子的表面進行消毒殺菌30s~60s，乙醇具有 較強的穿透力，使菌體蛋白變性，殺菌效果較好。同時本發明中的乙醇還作為潤濕劑，將國 槐種子表面進行潤濕，排除國槐種子上的空氣，利于取(：1 2的滲入；同時，本發明中采用的 TritonX-100使取(：12藥劑更容易展布，更加容易使HgCl2藥劑浸入到滅菌的國槐種子表 面，乙醇、HgCljPTritonX-100三者共同作用不可缺少，降低種子的染菌率，染菌率為0%。
[0025] (3)另外，由于國槐種子的種皮有細胞緊密結合的柵欄層，柵欄層排列緊密使得 表皮沒有細胞間隙，并且與空氣接觸的細胞壁上有著過厚的角質層，這些脂類的角質添加 在纖維分子的間隙中并包覆在國槐種子表面，使得國槐種子透水性差，萌發時間長，發芽率 低。針對國槐種子的生長特性，本發明采用TritonX-100溶解國槐種皮表面的脂質，增加 水分對細胞的通透性以及透氣性，有利于種子的呼吸作用和種子內貯藏物質的轉化，再通 過搖床暗培，使得國槐快速的萌發成胚根，并且TritonX-IOO作用均衡，可以獲得生長狀態 一致的剛剛萌動的胚根。
【附圖說明】
[0026] 圖1是本發明中的國槐胚根。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
[0028] 實施例1
[0029] -種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法，包括以下步驟：
[0030] (1)種子的挑選：挑選成熟飽滿的種子，種子保存時間不超過一年；
[0031] (2)種子的消毒：將種子采用體積分數為75%的乙醇溶液消毒40s，無菌水沖洗1 次，然后采用HgCljPTritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）的混合溶液浸泡12min，浸泡 之后采用無菌水沖洗6次，其中HgCljPTritonX-100的質量分數都為0. 1 %;
[0032] (3)接種：滅菌后的種子用濾紙吸干水后放置在裝有無菌水的無菌瓶中，水深剛 剛沒過種子即可，每瓶接種10粒種子；
[0033](4)培養：放置在搖床上暗培，溫度25°C，搖床轉速80轉/min。
[0034] 實施例2
[0035] -種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法，包括以下步驟：
[0036] (1)種子的挑選：挑選成熟飽滿的種子，種子保存時間不超過一年；
[0037] (2)種子的消毒：將種子采用體積分數為70%的乙醇溶液消毒30s，無菌水沖洗1 次，然后采用HgCljPTritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）的混合溶液浸泡14min，浸泡 之后采用無菌水沖洗6次，其中HgCljPTritonX-100的質量分數都為0. 09%;
[0038] (3)接種：滅菌后的種子用濾紙吸干水后放置在裝有無菌水的無菌瓶中，水深剛 剛沒過種子即可，每瓶接種10粒種子；
[0039] (4)培養：放置在搖床上暗培，溫度23°C，搖床轉速90轉/min。
[0040] 實施例3
[0041] 一種國槐種子快速萌發獲得胚根的方法，包括以下步驟：
[0042] (1)種子的挑選：挑選成熟飽滿的種子，種子保存時間不超過一年；
[0043] (2)種子的消毒：將種子采用體積分數為75%的乙醇溶液消毒60s，無菌水沖洗1 次，然后采用HgCljPTritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）的混合溶液浸泡10min，浸泡 之后采用無菌水沖洗6次，其中HgCljPTritonX-100的質量分數都為0. 08%;
[0044] (3)接種：滅菌后的種子用濾紙吸干水后放置在裝有無菌水的無菌瓶中，水深剛 剛沒過種子即可，每瓶接種10粒種子；
[0045](4)培養：放置在搖床上暗培，溫度28°C，搖床轉速70轉/min。
[0046] 申請人經過長期實踐與分析，本發明中的藥劑（HgCljPTritonX-100)濃度直接 影響滅菌效果，從而影響萌發率和污染率，濃度