多倍體千斤拔及其培育方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術育種領域，具體涉及多倍體千斤拔及其培育方法。
【背景技術】
[0002]千斤拔Moghania philippinens (Merr.et Rolfe) L1.為豆科千斤拔屬植物，另U名蔓千斤拔、吊馬粧、吊馬墩、一條根、老鼠尾、鉆地風(四川)等，以根入藥，主要分布于云南、四川、貴州、湖北、湖南、廣西、廣東、海南、江西、福建和臺灣。已有的研究表明，千斤拔皂苷對修復神經損傷、治療老年性癡呆、抗炎鎮痛、增強免疫、抗疲勞、抗缺氧有明顯作用，中國醫科院、中國藥科大學等都設置了專門的新藥研究課題，澳大利亞等國已進入藥理實驗階段。千斤拔還是國內制藥企業用于生產治療婦科炎癥、風濕骨痛、跌打損傷、壯腰健腎類藥品不可或缺的原料。現有常規二倍體千斤拔藥材的單株產量較低，根部纖維含量較高，不利于其中有效成分的提取。
[0003]通過倍數性育種手段使千斤拔基因組多倍化，可以獲得株型大、藥材產量高、出膏率高的品種。目前尚未發現有多倍體千斤拔及其培育方法的相關報道。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種多倍體千斤拔及其培育方法。該方法以特定濃度的秋水仙素為誘導劑，通過人工誘導獲得千斤拔同源四倍體品種，繼而再獲得三倍體千斤拔。
[0005]本發明所述多倍體千斤拔及其培育方法包括四倍體千斤拔以及它的培育方法、三倍體千斤拔以及它的培育方法。
[0006]具體地，本發明包括四倍體千斤拔的培育方法，包括以下步驟:
[0007]I)獲取二倍體千斤拔的種子苗；
[0008]2)選取生長勢強的種子苗經暗培養后，以秋水仙素為誘導劑，采用液體或固體法誘導種子苗產生染色體基因組倍數性變化，之后轉入分化培養基中進行光照培養，獲得叢生芽；其中:
[0009]所述采用固體法誘導種子苗產生染色體基因組倍數性變化是指:將經暗培養的種子苗轉接到含有0.015?0.035%質量秋水仙素的MS固體培養基中，于5?10°C條件下培養2?5d ;
[0010]所述采用液體法誘導種子苗產生染色體基因組倍數性變化是指:在無菌條件下，將經暗培養的種子苗浸泡于經過滅菌的質量濃度為0.05?0.1 %秋水仙素溶液中8?1h ；
[0011]3)切取叢生芽轉入生根培養基中培養成根莖葉完整的植株；
[0012]4)對所得植株進行染色體數目檢測，篩選出四倍體植株(染色體數目2n = 4x =44的植株)；
[0013]5)所得四倍體植株按常規技術種植，得到四倍體千斤拔。
[0014]上述方法的步驟I)中，可以按現有常規技術將二倍體千斤拔的種子培養成種子苗，這里不再詳述。
[0015]上述方法的步驟2)中，所述的分化培養基配方為:MS+6-BA 0.5?1.0mg/L+NAA0.05?0.2mg/L+蔗糖2?5% +瓊脂0.4?0.5%，更優選的分化培養基配方為:MS+6_BA0.53mg/L+NAA 0.12mg/L+蔗糖3% +瓊脂0.5%。在分化培養基中進行光照培養的培養條件與現有技術相同，優選為:溫度為20?28°C，光照時間為10?12h/d，光照強度為1000?20001xo該步驟中，所述暗培養的操作及培養條件與現有技術相同。
[0016]上述方法的步驟2)中，在用液體法誘導種子苗產生染色體基因組倍數性變化時的操作溫度與現有技術相同，通常是在18?25°C條件下進行。
[0017]上述方法的步驟3)中，所述的生根培養基配方為:l/2MS+6-BA 0.01?0.1mg/L+NAA 0.4?1.0mg/L+蔗糖2?5 % +瓊脂0.4?0.5 % +活性炭0.2?0.5 %，優選的生根培養基配方為:l/2MS+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.45mg/L+蔗糖2% +瓊脂0.5% +活性炭0.5%。在生根培養基中的培養條件與現有技術相同，優選為:所述光照培養的條件為:溫度為20?28°C，光照時間為10?12h/d，光照強度為1000?20001x。
[0018]上述方法的步驟4)中，為了減少染色體數目檢測的工作量，可以將步驟3)獲得的根莖葉完整的植株與常規二倍體植株對照，以葉片大小、顏色，莖干作為指標，篩選出有明顯變化的植株作為染色體倍數性加倍的候選植株，再檢測這些候選植株的染色體數目，以篩選得到四倍體植株。對植株進行染色體數目檢測的方法與現有技術相同，具體可以是:剪取目標株幼嫩根尖或莖尖0.5cm，用卡諾固定液(無水乙醇:冰乙酸=3:1)固定15min以上，流水下沖洗15min，解離液(濃鹽酸:甲醇=I:1)解離2?30min，清水沖洗15min，切取根尖、莖尖0.1mm，用卡寶品紅染色液染色，壓片觀察統計根尖或莖尖染色體。
[0019]本發明還包括由上述方法培育得到的四倍體千斤拔。
[0020]本發明進一步包括三倍體千斤拔的培育方法，包括以下步驟:
[0021]a)按權利要求1所述方法培育得到四倍體千斤拔；
[0022]b)將四倍體千斤拔和二倍體千斤拔進行人工授粉雜交，得到雜交千斤拔種子；
[0023]c)將雜交千斤拔種子繁殖成完整植株，篩選出三倍體植株；
[0024]d)所得三倍體植株按常規技術種植，得到三倍體千斤拔。
[0025]上述方法的步驟a)中的操作與前述四倍體千斤拔的培育方法相同。
[0026]上述方法的步驟b)中，是將培養得到的四倍體植株和二倍體植株按常規技術進行大田種植，開花時人工授粉雜交(罕4NX ? 2Ν, ? 4ΝΧ罕2Ν)，得到雜交千斤拔種子。
[0027]上述方法的步驟c)中，篩選三倍體植株的方法與現有技術相同，在此不再詳述。
[0028]本發明還包括由上述方法培育得到的三倍體千斤拔。
[0029]與現有技術相比，本發明提供了四倍體千斤拔的培育方法、三倍體千斤拔的培育方法，以及由上述方法培育得到的四倍體千斤拔和三倍體千斤拔。本發明所述方法以特定濃度的秋水仙素為誘導劑，通過人工誘導獲得千斤拔同源四倍體品種；再將四倍體與常規二倍體進行雜交授粉，繼而獲得三倍體千斤拔。所得多倍體千斤拔的根、莖、葉、花及其有效成分明顯大于或高于二倍體親本，不僅有效提高了千斤拔藥物的產量，且由于有效成分含量的提高還可獲得更高的出膏率(即提高千斤拔提取物中有效成分的含量)。
【附圖說明】
[0030]圖1為常規二倍體千斤拔染色體圖片；
[0031]圖2為四倍體千斤拔染色體圖片；
[0032]圖3為所得四倍體千斤拔植株與常規二倍體千斤拔植株的對比圖片，其中右側圖為四倍體千斤拔植株。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述，以更好地理解本發明的內容，但本發明并不限于以下實施例。
[0034]實施例1:四倍體千斤拔的培育
[0035]I)選取優良二倍體植株所結實的成熟、飽滿、顆粒大的種子，用清水沖洗2?4次，在無菌條件下用0.1%升汞處理5min，無菌水洗6次；之后分別接到萌芽培養基(MS固體培養基)中進行催芽培養得到種子苗；
[0036]2)選取生長勢強的種子苗暗培養5d后，在無菌條件下將其完全浸泡在滅菌好的質量濃度為0.05%的秋水仙素溶液中，于10°C下培養8h，取出后用無菌水洗凈，轉到分化培養基(MS+6-BA 0.53mg/L+NAA 0.12mg/L+蔗糖3% +瓊脂0.5% )中進行光照培養，每天光照10h，光照強度為1000?15001x，培養溫度為25°C，直到長出新芽(即叢生芽)；
[0037]3)切取經分化培養長出的新芽轉入生根培養基(1/2MS+6-BA 0.05mg/L+NAA0.45mg/L+蔗糖2% +瓊脂0.5% +活性炭0.5% )中進行光照培養，每天光照10h，光照強度為20001x，培養溫度為25°C，直到培養得到根、莖、葉完整的植株；
[0038]4)將步驟3)獲得的植株與二倍體植株進行對照，將葉片大小、顏色有明顯變化的植株作為基因組可能加倍的候選植株，并對候選植株的染色體數目進行檢測，以篩選出四倍體植株；染色體數目的檢測方法如下(下同):剪取植株的根尖0.5cm，用卡諾固定液固定15min以上，流水下沖洗15min,解離液解離10?20min，清水沖洗15min，切取根尖
0.1_，卡寶品紅染色液染色，壓片觀察統計根尖染色體數目，進而篩選出四倍體植株(圖2為四倍體千斤拔染色體圖片，圖1為常規二倍體千斤拔染色體圖片，圖3為所得四倍體千斤拔植株與常規二倍體千斤拔植株的對比圖片，其中右側圖為四倍體千斤拔植株，由圖3可見，四倍體千斤拔植株的根、莖、葉均大于常規二倍體千斤拔植株);
[0039]5)將步驟4)篩選出的四倍體植株按常規技術種植，得到四倍體千斤拔。
[0040]實施例2:三倍體千斤拔的培育
[0041 ] a)按實施例1所述方法培育得到四倍體千斤拔植株；
[0042]b)將四倍體千斤拔植株和二倍體千斤拔植株進行大田種植，開花時人工授粉雜交(早4NX ? 2N或? 4ΝΧ罕2Ν)，得到雜交千斤拔種子；
[0043]c)將雜交千斤拔種子按現有常規技術繁殖成完整植株，再按現有常規方法對所得植株的染色體數目進行檢測，篩選出三倍體植株；
[0044]d)所得三倍體植株按常規技術種植，得到三倍體千斤拔。
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