一種采用幼胚挽救獲得芝麻遠緣雜交后代的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術育種領域，具體涉及一種采用幼胚挽救獲得芝麻遠緣雜交后代的方法。
【背景技術】
[0002]芝麻(Sesamum indicumL，2η = 26)屬胡麻科胡麻屬，是我國重要的優質油料作物和特色農產品。然而，由于栽培物種在長期進化和人工選擇中，原本存在于野生物種的許多優良基因被淘汰，導致雜交親本間遺傳基礎越來越狹窄，遺傳的多樣性越來越貧乏。現有芝麻栽培品種抗病耐漬性較差，易受環境條件的影響，產量的穩定性不佳，特別是遇到多雨年份，芝麻澇害嚴重、枯萎病和莖點枯病的發生，致使大面積枯死，產量和品質大幅度降低，嚴重影響芝麻生產的發展。野生芝麻在長期進化過程中形成了適應不同自然環境的極其豐富的遺傳多樣性，聚集了很多有利基因。芝麻屬中的有些野生種具有高抗病抗逆耐漬等特性，將野生種的極為豐富的遺傳多樣性和寶貴的抗病蟲、抗逆境的基因導入栽培種可以增加栽培種資源的遺傳多樣性，對創制優良新種質和培育新品種具有重要意義，是解決芝麻產量低而不穩的一條有效途徑。
[0003]近二十年來，國內外學者先后就芝麻屬遠緣雜交技術開展了大量研究，但是采用常規的雜交方法，芝麻野生種與栽培種種間雜交并不能獲得種間雜交F1后代(Kedharnath, 1961)。如 Tarihal Ramesh 等用‘野芝 I 號’(S.radiatum 2n = 64)做母本與栽培品種(2n = 26)正反交結果得到的種子沒有發芽；劉紅艷等用‘剛果野芝麻(2n =64) ’和‘野芝I號(2n = 64) ’與栽培品種(2n = 26)進行正反種間雜交，未能得到匕植株。到目前為止，國內外利用幼胚挽救離體培養技術實現親緣關系較遠的芝麻種間雜交并獲得雜交后代F1植株還未有報道。
[0004]幼胚(珠)離體培養技術是通過人為改善幼胚發育條件，提供幼胚發育必需的營養物質，促使幼胚發育成植株，是目前克服受精后發育障礙的有效方法，為創造遺傳新種質提供一條重要途徑。目前，親緣關系較遠的芝麻種間雜交不易成功，芝麻在進行遠緣雜交時普遍存在雜交不結實，結蒴率低和結籽率低，雜種胚不發育等現象。因此，利用幼胚挽救離體培養技術，將野生種的抗病抗逆特性轉入栽培種，進行芝麻栽培品種的種質改良，是提高芝麻品種抗性特征的重要技術途徑。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種采用幼胚挽救獲得芝麻遠緣雜交后代的方法，解決了親緣關系較遠的野生種芝麻與栽培品種芝麻、野生種芝麻與半野生種芝麻在進行遠緣雜交時存在的雜交不結實，雜種胚敗育，無法獲得雜種F1植株等問題。
[0006]為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為:
[0007]—種采用幼胚挽救獲得芝麻遠緣雜交后代的方法，包括如下步驟:
[0008](I)親本材料準備:母本選用芝麻栽培品種(2n = 26)，父本選用芝麻野生種(S.prostratum, 2n = 58)或母本選用芝麻野生種(S.schinzianum，2n = 64)，父本選用半野生種(S.malabaricum, 2n = 26);精選無病飽滿的父母本籽粒以備種植；
[0009](2)遠緣雜交:當父母本均開花時，摘掉母本露白的花冠和雄蕊；用父本雜交授粉；
[0010](3)胚珠的剝取:取步驟(2)雜交授粉后生長發育了 10?18天的幼蒴，用清水將幼蒴表面沖洗干凈，然后在無菌條件下對幼蒴表面進行消毒并用無菌水漂洗，最后切開幼蒴，輕輕剝出胚珠；
[0011](4)幼胚挽救離體誘導培養:在無菌條件下，將步驟(3)得到的胚珠接種到幼胚誘導培養基中，在溫度28?30°C、光周期8?16h/d、光照強度1500?20001ux條件下離體誘導培養，使胚珠萌發得到幼胚；
[0012](5)幼胚的分化培養:將步驟(4)得到萌發的幼胚接種到分化培養基中，在溫度28?30°C、光周期8?16h/d和光照強度1500?20001ux條件下分化培養直至幼胚發育成雜種Fi幼苗；
[0013](6)雜種F1植株的獲得、繁殖與保存:在無菌條件下，從培養基中取出雜種F #力苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片葉子，將幼苗頂芽區段置于生根培養基中培養直至形成完整的雜種匕植株后放在人工氣候培養箱中保存；將幼苗除頂芽外的其它區段置于增殖培養基中進行擴繁，直至誘導分化出頂芽后，再將頂芽接種到生根培養基中培養直至形成完整的雜種F1植株并保存。
[0014]上述方案中，步驟(3)所述取雜交授粉后生長發育了 12d?18d的幼蒴。
[0015]上述方案中，當母本選用芝麻栽培品種(2n = 26)，父本選用芝麻野生種(S.prostratum, 2n = 58)時，所述幼胚誘導培養基為:在MS基本培養基中添0.3?0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)、0.3?lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，培養基pH值為5.8 ;當母本選用芝麻野生種(S.schinzianum，2n = 64)，父本選用半野生種(S.malabaricum, 2n = 26)時，所述幼胚誘導培養基為:0.I?0.3mg/L NAA(萘乙酸)、1?2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、50g/L蔗糖和8g/L瓊脂，培養基pH值為5.8。
[0016]上述方案中，所述分化培養基為:在MS基本培養基中添加0.1?0.3mg/L IAA、0.1?0.6mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，培養基的pH值為5.8。
[0017]上述方案中，步驟(4)所述離體誘導培養的培養時間為25?30d ;步驟(5)所述分化培養的培養時間為25?30d。
[0018]上述方案中，所述生根培養基為:在MS基本培養基中添加0.2?0.5mg/L NAA (萘乙酸)、0.lmg/L?0.3mg/L IBA(吲哚丁酸)、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，培養基的pH值為5.8。
[0019]上述方案中，所述增殖培養基為:在MS基本培養基中添加、1.5?3mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、I?2mg/L IAA (吲哚乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂，培養基的pH值為5.8。
[0020]上述方案中，所述幼苗頂芽區段置于生根培養基中培養至形成完整的雜種F1植株的時間為20d?30d。
[0021]上述方案中，所述幼苗除頂芽外的其它區段置于擴培培養基中擴繁直至誘導分化出頂芽的時間為14d?20d。
[0022]本發明還采用了分子標記鑒定法對芝麻野生種和栽培種或者芝麻野生種與半野生種遠緣雜交獲得雜種匕植株的真實性進行判斷，具體的鑒定方法為:
[0023](I)當母本選用芝麻栽培品種(2η = 26)，父本選用野生種(S.prostratum，2η=58)時，分別提取母本芝麻栽培品種(2n = 26)與父本野生種(S.prostratum，2n =58)及其雜種F1植株的基因組DNA，分別將母本、父本和雜種F i植株作為模板.用SSR引物 HS142(GenBank, JP643611):正向引物序列:5’-ATTGTCGTTGTCGTTGTCGT-3’、反向引物序列:5’-AACTCCATCAACCTATGCCC-3’進行PCR反應，然后將PCR反應產物進行凝膠電泳分析；在凝膠成像儀上照相觀察；根據在雜種F1植株的凝膠電泳帶型上有無親本的特異擴增條帶，在早期鑒定雜種F1植株是否為真雜種，若雜種F i植株的電泳帶型上在220bp有母本栽培品種(2n = 26)的特異性擴增條帶、在210bp有父本(S.prostratum, 2n = 58)的特異性擴增條帶，則可以判斷該雜種F1植株為真雜種，若沒有