一種提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物修復土壤重金屬污染領域，具體涉及到一種利用染色體加倍改良鋅鎘超積累植物東南景天基因型的方法。
【背景技術】
[0002]近年來土壤鎘污染日益嚴重，土壤中的鎘通過植物(或植物到動物)進入人體，危害人類的健康。如何治理和減輕土壤中的鎘污染，成為目前急需解決的問題。植物修復是一種比較環保有前途的方式。東南景天是一種鋅鎘超積累植物，能夠將鋅鎘較多的吸收積累至地上部，從而減輕土壤重金屬污染。但是，東南景天的生物量相對較低，雖然相對積累量高，仍難以滿足植物修復的需求。如何利用這一優良資源，提高污染土壤植物修復效率尤為重要。
[0003]例如，公開號為CN101444185A的中國發明專利申請文獻公開了一種重金屬超積累植物東南景天種苗的繁殖方法，其特征是采用葉片愈傷組織誘導法，將東南景天葉片消毒，切去葉緣、葉脈和葉柄，切成0.2?0.3cm的小片，接種到已滅菌的玻璃培養瓶裝的pH為5.5?5.8誘導培養基上，將培養瓶放入溫度為± 25°C，無光照的培養箱中I?2周誘導愈傷組織，將愈傷組織轉移至已滅菌的玻璃培養瓶裝的pH為5.5?5.8分化培養基中，再將培養瓶放入溫度為±25°C，每天保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養箱中培養40?50天，得到3?5cm高帶有Icm以上幼根的幼苗，然后將培養瓶移到室外，打開瓶口，加入少許蒸餾水放置2?3天后，用水洗去培養基，移栽至蛭石:珍珠巖比例3: I的基質，或有機質基質中，2?4周得到種苗。
[0004]公開號為CN 1973617A的中國發明專利申請文獻公開了一種重金屬超積累植物東南景天種苗的繁殖方法，采用莖段扦插法，將東南景天剪成3cm以上帶腋芽的莖段，直接扦插到到受重金屬污染的土壤中，按傳統農耕法管理生長，待植物生長至15cm?30cm收割地上部，作為種苗再次被剪成3cm以上帶腋芽的莖段，扦插到污染環境的土壤中；或者將東南景天剪成3cm以上帶腋芽的莖段，直接扦插到育苗基質或營養液中，按傳統農耕法管理生長，得到種苗。
【發明內容】
[0005]本發明提供一種提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，通過誘導東南景天染色體加倍，再經過檢測獲得加倍材料，提高東南景天對重金屬的超積累能力。
[0006]—種提高超積累植物東南景天對重金屬超積累能力的方法，包括如下步驟:
[0007](I)將離體的東南景天植株切成含有完整腋芽的莖段，浸入無菌秋水仙素溶液中，密封避光，并放入溫度為25°C ±1°C的搖床中振蕩；
[0008](2)取出步驟(I)處理后的離體帶腋芽莖段經無菌水沖洗后接種于分化培養基上，培養至腋芽處長出叢生芽；
[0009](3)將所得的叢生芽接種于生根培養基中，進行生根培養；
[0010](4)取生根培養后的完整植株的嫩葉在流式細胞儀上檢測所獲得株系的倍性，選擇變異植株；
[0011](5)取變異植株，切成莖段，在生根培養基中培養獲得無菌苗。
[0012]將變異植株即無菌苗與對照株在加鎘的培養基中進行鎘處理，檢測其體內鎘積累量。
[0013]東南景天的超積累效應得益于其特異基因的表達，染色體的加倍能使這些基因相對過表達，從而提高修復效果；同時，加倍后會使其莖桿粗壯，生物量增大。
[0014]人工誘導染色體加倍的方法中，秋水仙素加倍技術比較簡單有效，使用最多。秋水仙素是一種從百合科植物秋水仙中提取出來生物堿，能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期，在這樣的有絲分裂中，染色體雖然縱裂，但細胞不分裂，不能形成兩個子細胞，因而使染色體加倍。加倍后的多倍體通常具有更強的抗逆性與適應性。東南景天以無性繁殖為主，能從葉腋處長出大量腋芽，快速繁殖。葉腋是東南景天分裂旺盛的組織區域，以秋水仙素處理，效果最好。
[0015]優選地，所述秋水仙素溶液的質量濃度為0.1?0.2%。最優選為0.2%。
[0016]優選地，步驟(I)中在搖床中震蕩培養24_72h。進一步優選24h。
[0017]優選地，所述分化培養基的組成為:基礎培養基MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA, pH 5.8。優選地，所述生根培養基的組成為:1/2MS+8.0g/L瓊脂 +30.0g/L 蔗糖 +0.2mg/L 2，4-D，ρΗ5.8。
[0018]優選地，步驟(4)中倍性檢測的方法包括如下步驟:
[0019](I)取嫩葉片放在預冷的培養皿中，加入預冷的Ottol，切碎，解離；
[0020](2)吸取步驟⑴培養皿中的解離液，用400目濾膜過濾到離心管中，于3?5°C解育3?5min ；
[0021 ] (3)離心棄去上清液，加入預冷的OttoI，再加入OttoII，最后加入預冷PI染液，置于3?5°C條件下避光染色8?1min ;0ttol、OttoII和PI染液的體積比為1:4:5 ；
[0022](5)移至上樣管，上流式細胞儀檢測。
[0023]進一步地:0ttol的組成為:0.lmol/L 檸檬酸，0.5% (v/v) Tween20, pH 2.0-3.0，4°C保存；0ttoII的組成為:0.4mol/L十二水磷酸氫二鈉，pH 2.0-3.0，常溫保存；PI (碘化丙啶)染液濃度為0.05mg/ml，每ml加入250 μ g RNA酶，錫紙包裹，避光，4°C保存。
[0024]步驟(4)中倍性檢測的方法更進一步地，具體步驟為:
[0025]I)取約0.5g葉片放在預冷的培養皿中，加入Iml預冷的Ottol，用鋒利的刀片一次性快速切碎；
[0026]2)吸取培養皿中的解離液，用400目濾膜過濾到1.5ml離心管中，于4°C冰箱孵育5min ；
[0027]3)離心，轉速 1000r/min，溫度 4°C，時間 5min ;
[0028]4)棄去上清液，加入預冷的OttoI 20μ1，再加入OttoII 80 μ 1，最后加入100 μ I預冷的碘化丙啶PI染液，每個樣共約200 μ I細胞核懸浮液。置于4°C冰箱，避光染色1min ；
[0029]5)移至上樣管，上機檢測。
[0030]優選地，當步驟(3)中的植株長到5cm高后，上流式細胞儀上檢測。
[0031]本發明方法處理條件簡單易控制，重復性高，省時省力。
【附圖說明】
[0032]圖1A為Otto’s提取、PI染液染色后流式細胞儀檢測東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖，圖1B為Otto’ s提取、PI染液染色后流式細胞儀檢測加倍東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖。
[0033]圖2為東南景天植株比較圖，圖2A為對照植株形態圖，圖2B為倍性增加植株形態圖。
[0034]圖3為用Otto’ s提取PI染色后，顯微鏡下觀察到的細胞核。
[0035]圖4為鎘脅迫下東南景天對照植株與倍性增加植株體內鎘含量。
[0036]圖5A為Tris.MgCl2提取劑提取、PI染液染色后流式細胞儀檢測東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖，圖5B為Tris.MgCl2提取劑提取、PI染液染色后流式細胞儀檢測加倍東南景天葉片相對DNA含量分布直方圖。
【具體實施方式】
[0037]實施例1
[0038](I)無菌苗的獲得:取東南景天上半段植株經流水沖洗20分鐘后，用75%的乙醇浸泡殺菌60s，再置于0.1 %的取(:12消毒5min，用無菌水沖洗4_5次后，將其平放在高壓滅菌過的濾紙上，用無菌手術刀將片切成小塊，然后接入MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+3.0mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA的培養基上繼代培養，生長一段時間后獲得大量叢生芽，再轉入1/2MS+8.0g/L瓊脂+30.0g/L蔗糖+0.2mg/L 2，4_D的培養基中進行生根培養，獲得大量的無菌苗供實驗選用。
[0039](2)秋水仙素加倍:選取健壯無菌苗放在無菌濾紙上，用無菌手術刀把大葉片切去一半，再將莖桿切成莖段，莖段上包含完整腋芽，然后放入高壓滅菌過的0.2%的秋水仙素溶液中浸泡。將盛裝離體帶腋芽莖段和秋水仙素溶液的錐形瓶用封口膜和橡皮筋進行封口，保證其與外界隔離，用錫紙包裹避光，放入溫度為25°C ± IV的搖床中振蕩24h，轉速為10rpm0