一種菊苣原生質體誘導純合四倍體植物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物原生質體培養領域，具體涉及一種菊苣原生質體誘導純合四倍體 植物的方法，該方法采用秋水仙素對菊苣原生質體進行誘導，得到四倍體再生植株。
【背景技術】
[0002] 菊苣（CichoriumintybusL.)屬于菊科，是多年生草本植物，為食、藥及飼料三用 作物，其根部含有豐富的菊粉、低聚及超高果糖，對人體健康十分有益，亦可深加工成為低 熱量的保健食品和咖啡替代品；軟化菊苣可作鮮食用高檔蔬菜；此外，菊苣還是一種高產 優質牧草。
[0003] 菊苣原產歐洲，于20世紀80年代初引進中國，開始了大面積試種和快速推廣，具 有良好的發展潛力。但是，菊苣的育種在國內基本處于空白，現用的品種幾乎全部從國外引 進，而這些國外品種在適應性和抗性等重要農藝性狀上表現較差，必須加以改良。所以，我 們迫切需要開展自己的育種工作，培育出更適合中國種植條件的，具有知識產權的菊苣新 品種。
[0004] 原生質體融合（即體細胞雜交）是比較實用的生物技術之一，可以用于常規育種 方法無法完成的種間或屬間遠源雜交，獲取更大的雜種優勢，引進優秀的農藝性狀（例如： 適應性，抗病性，抗逆性等），培育菊苣新品種或育種材料，豐富種質資源。原生質體培育是 實施體細胞雜交的前提和基礎，而菊苣的原生質體培育技術體系在國內尚未建立；雖然國 外已有菊苣原生質體培育及融合等方面的報道（Rambaud1996)，但無論在培養效率上，還 是在技術內容及方法的實用性上，都需要加以改進和提高，才能加快我國的菊苣育種，盡快 地培養出具有中國特色的新品種。
[0005] 多倍體的離體誘導技術對菊苣的育種及改良十分有益，四倍體或三倍體等植株具 有營養體"巨型性"的特點，可以大幅度提高其收獲器官--塊根的產量（增產30-50% )， 同時還可提高菊苣有效成分的含量（如菊粉糖等），以及改善抗病性、抗逆性和適應性。國 內常規的菊苣多倍體誘導方法，通常是運用秋水仙素等化學藥劑處理菊苣的器官，組織，愈 傷組織或多細胞團，得到的多倍體植株往往伴有混倍體和嵌合體，需要反復多次的繼代，分 離培養，才能篩選出純合的多倍體植株，其過程不但費工費時，而且純合多倍體的誘導頻 率不高。國外利用原生質體融合技術，誘導出了菊苣四倍體，但是其四倍體的誘導頻率低 (Rambaud等，I"6) 〇
[0006] 因此，植物外植體培養領域的科研和實踐中，需要一種利用菊苣原生質體培養，結 合秋水仙素處理，能夠一次性獲得高效的純合四倍體的誘導方法。
【發明內容】
[0007] 本發明提供一種菊苣原生質體誘導純合四倍體植物的方法，該方法采用秋水仙素 對菊苣原生質體進行誘導，得到四倍體再生植株。
[0008] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0009] -種菊苣原生質體誘導純合四倍體植物的方法，包括如下步驟：
[0010] 酶解步驟：向二倍體菊苣培養材料中加入酶解液，進行酶解處理，得到酶解產物； 將所述酶解產物進行收集處理，得到原生質體懸液；
[0011] 純化步驟：將所述原生質體懸液進行清洗處理，再加入蔗糖溶液進行純化處理，得 到純化后的原生質體；
[0012] 誘導步驟：將所述純化后的原生質體放置于秋水仙素加倍液中，進行誘導處理，得 到加倍后的原生質體；
[0013] 細胞團和小愈傷組織培養步驟：將所述加倍后的原生質體用原生質體培養基YJ1 進行清洗處理，再用原生質體培養基JY2進行包埋培養，得到細胞團和小愈傷組織；
[0014] 愈傷組織繁殖和胚狀體誘導步驟：將所述細胞團和小愈傷組織于原生質體培養基 YJ3培養基進行誘導培養，得到愈傷組織和胚狀體；
[0015] 分化步驟：將所述愈傷組織和胚狀體于分化培養基JY4進行分化培養，得到再生 芽。
[0016] 上述方法的優選的實施方式中，所述酶解步驟中，所述酶解液包括：質量百分比 濃度為〇. 1-1. 〇%、優選為〇. 25%的纖維素酶R-10,質量百分比濃度為0. 1-1. 0%、優選為 0. 2%的果膠酶。
[0017] 上述方法的優選的實施方式中，所述酶解步驟中，所述酶解液中還包括：10mM的 0&(：12*21120,0.71111的1(11 2?04，質量百分比濃度為8%-12%的甘露醇，質量百分比濃度為 0? 05-0. 2%的2-(N-嗎啉）乙磺酸。
[0018] 上述方法的優選的實施方式中，所述酶解步驟中，所述酶解處理的時間為5-6小 時，優選為5. 5小時。
[0019] 上述方法的優選的實施方式中，所述誘導步驟中，所述秋水仙素加倍液中，含有質 量濃度百分比為〇. 1-1 %，優選為〇. 1-0. 5%，更優選為0. 3%的秋水仙素。
[0020] 上述方法的優選的實施方式中，所述誘導步驟中，所述秋水仙素加倍液中，還含有 10mM的CaCl2 ? 2H20,0. 7mM的KH2P04和質量百分比濃度為8% -12%的甘露醇。
[0021] 上述方法的優選的實施方式中，所述誘導步驟中，所述誘導處理的時間為1-12小 時，優選為1-5小時，更優選為3小時。
[0022] 上述方法的優選的實施方式中，所述細胞團和小愈傷組織培養步驟中，所述包埋 培養中，將固化后的原生質體薄層于24-28°C，優選為26°C，無光照培養2-3周。
[0023] 上述方法的優選的實施方式中，所述愈傷組織繁殖和胚狀體誘導步驟中，所 述誘導培養中，溫度為24-28°C，優選為24°C，光周期為10小時光照/天，光照強度為 800-1200LUX，優選為 1000LUX。
[0024] 上述方法的優選的實施方式中，所述分化步驟中，所述分化培養中，溫度為 24-28°C，優選為24°C，光周期為16小時光照/天，光照強度為2000-3000LUX，優選為 2500LUX。
[0025] 相比現有技術，本發明具有如下有益效果：
[0026] 1、本發明利用秋水仙素對菊苣原生質體進行誘導處理，且每個步驟、各個參數之 間協同作用，四倍體植株再生率較高；遠高于采用原生質體融合方法誘導。
[0027]2、本發明采用的是單細胞加倍法，菊苣純合四倍體是利用秋水仙素短時間處理單 個原生質體，最后形成的再生植株由加倍的原生質體起源的，經過離體培養，一次性形成的 多倍體植株。
[0028] 3、本發明相比原生質體融合加倍法，具有的優點為：誘導多倍體植株的倍性可控 性高，排除了原生質體融合加倍法產生6倍體及8倍體植株的可能性；由二倍體菊苣原生質 體再生的混倍體植株率和嵌合體植株率均為零，排除了組織加倍法所必需的多期繼代，篩 選和純化四倍體植株的繁瑣培養過程。
【附圖說明】
[0029] 圖1為試驗例3中，采用2種不同的誘導方法對菊苣原生質體加倍處理后，四倍體 植株再生率柱狀圖。
【具體實施方式】
[0030] 一種菊苣原生質體誘導純合四倍體植物的方法，包括如下步驟：
[0031] 步驟一、酶解：向二倍體菊苣培養材料中加入酶解液，進行酶解處理，得到酶解產 物；將所述酶解產物進行收集處理，得到原生質體懸液。
[0032] 具體的操作為：
[0033] (1)酶解處理：取7-14日齡、二倍體菊苣種子的無菌苗的葉片、或生長健壯的組培 苗的葉片，縱切成為2-3毫米的細條，除去葉片的中央主脈及邊緣，放入酶解液中，葉片與 酶解液的質量體積比為1克：10毫升，置于黑暗條件下于30-34°C，優選為32°C，酶解5-6小 時，優選為5. 5小時，得到酶解產物；
[0034]示例性地，上述酶解處理的溫度可以為30°C、31°C、33°C、34°C中的任意值或任意 二者之間的范圍；上述酶解處理的時間可以為5.lh、5. 5h、5. 6h、5. 8h、6h中的任意值或任 意二者之間的范圍；
[0035] 上述酶解液包括：質量百分比濃度為0. 1-1.0%的纖維素酶R-10,質量百分比 濃度為〇. 1-1. 〇 %的果膠酶，10mM的CaCl2 ? 2H20,0. 7mM的KH2P04，質量百分比濃度為 8% -12%的甘露醇，質量百分比濃度為0.05-0. 2%的MES(2-(N-嗎啉）乙磺酸）；該酶解 液以0. 22ym的微孔濾膜過濾滅菌；
[0036] 示例性地，上述酶解液中的纖維素酶R-10的質量百分比濃度可以為0. 1%、 0. 2 %、0. 5 %、0. 8 %、1 %中的任意值或任意二者之間的范圍；果膠酶的質量百分比濃度可 以為0. 1、0. 3 %、0. 5 %、0. 8 %、1 %中的任意值或任意二者之間的范圍。
[0037] (2)收集處理：將酶解產物經過200目和400目的不銹鋼篩的過濾，再加入CPW洗 液，洗出殘留在培養皿中的酶解產物，再用400目的不銹鋼篩過濾；再收集全部過濾后的原 生質體及CPW洗液，在500-1000rpm下離心8分鐘，棄上清，收集原生質體，得到原生質體懸 液。
[0038] 步驟二、純化：將原生質體懸液進行清洗處理，再加入蔗糖溶液進行純化處理，得 到純化后的原生質體。
[0039] 具體的操作為：
[0040] (1)清洗處理：向原生質體懸液中緩慢加入CPW洗液，在750rpm下離心8分鐘，保 留沉淀；此過程重復2次，即離心清洗2次，得到清洗后的原生質體；
[0041] 上述的每次離心處理中，轉速為750rpm，時間為8分鐘，再使用玻璃吸管棄除上清 液，并向沉淀中添加10毫升的CPW洗液；
[0042] (2)純化處理：取相等體積的22%的蔗糖溶液和清洗后的原生質體，在1500rpm下 離心15分鐘；于離心管中部的分層部位，收集原生質體帶；再向收集到的原生質體中添加 CPW液重新懸浮，在750rpm下離心8分鐘，洗除蔗糖殘液，得到純化后的原生質體。
[0043] 步驟三、誘導：將所述純化后的原生質體放置于秋水仙素加倍液中，進行誘導處 理，得到加倍后的原生質體。
[0044] 具體的操作為：
[0045] (1)將純化后的原生質體定量懸浮于秋水仙素加倍液中，得到混合懸液；每毫升 該混合懸液中包含60000個原生質體；
[0046] 秋水仙素加倍液中，除含有質量濃度百分比為0. 1-1%，優選為0. 1-0. 5%，更優 選為0. 3%的秋水仙素之外，還含有10mM的CaCl2 ? 2H20,0. 7mM的KH2P04和質量百分比濃 度為8-12%的甘露醇；該加倍液的pH值為5. 8,以0. 45ym微孔濾膜過濾滅菌；
[0047] 示例性地，上述秋水仙素的質量百分比濃度可以為0. 1%、0. 2%、0. 5%、0. 8%、 1 %中的任意值或任意二者之間的范圍。
[0048] (2)加倍處理：將密封在容器中的混合懸液置于轉速為20-25rpm搖床上，振蕩培 養原生質體1-12小時（優選為1-5小時，更優選為3小時），誘導染色體加倍，得到加倍混 合懸液；加倍處理的外界條件為溫度25°C，無光照；
[0049] 示例性地，上述加倍處理時間可以為lh、4h、6h、7h、8h、10h、12h中的任意值或任 意二者之間的范圍。
[0050] (3)向加倍混合懸液中添加CPW洗液，進行3次離心處理，得到加倍后的原生質 體；
[0051] 上述的每次離心處理中，轉速為750rpm，時間為8分鐘，再使用玻璃吸管棄除上清 液，并向沉淀中添加10毫升的CPW洗液。
[0052] 本步驟利用秋水仙素短時間處理單個原生質體，最后形成的植株是由加倍的原生 質體起源的，經過離體培養，一次性形成的多倍體植株。
[0053] 步驟四、細胞團和小愈傷組織培養：將加倍后的原生質體用原生質體培養基YJ1 進行清洗處理，再用JY2液體培養基進行包埋培養，得到細胞團和小愈傷組織。
[0054] 具體的操作為：
[0055] (1)清洗處理：向加倍后的原生質體中加入等體積的原生質體培養基YJ1，于轉速 750rpm離心8分鐘，保留沉淀，再向沉淀中加入原生質體培養基YJ1，得到原生質體YJ1懸 液；再將該懸液中的原生質體的培養密度調整為60000個/ml。
[0056] (2)包埋處理：在35°C預加熱融化原生質體培養基JY2,再于30°C吸取密度為 60000個/ml的原生質體YJ1懸液，按照1 :1的體積比與原生質體培養基JY2混合，搖勻后 迅速轉入培養皿，在其中