一種淡紫擬青霉菌劑的制備方法及裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農作物防病控病領域，更具體涉及一種淡紫擬青霉菌劑的制備方法，本發明的制備工藝簡單、成本低廉，適宜于推廣應用，同時還涉及一種淡紫擬青霉菌劑的制備裝置，該裝置簡單，使用方便。
【背景技術】
[0002]淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)作為一種重要的生防真菌，皆為昆蟲病原菌和線蟲病原菌。淡紫擬青霉防治譜比較廣，除能防治根結線蟲、孢囊線蟲外對常見的土傳病害如棉花枯萎病(王明祖等，1996)、水稻立枯病(肖炎農等，1996)等有較高的防效，具有較好的應用前景。同時由于淡紫擬青霉菌劑具有不污染環境、生產原料來源豐富、對人畜無害、靶標生物不容易產生抗藥性等優點，其研究與生產備受世人的關注。菲律賓亞州技術中心已將淡紫擬青霉商品化，以“B10C0N”出售這種真菌制劑，在秘魯、美國、巴基斯坦用于防治馬鈴薯線蟲效果顯著。在印度有產品“B1-Nematon”在生產上應用。我國也采用液體、固體發酵技術工業化生產商品制劑，在黑龍江、云南、江蘇等地防治大豆孢囊線蟲和南方根結線蟲效果顯著。高效生產淡紫擬青霉菌劑并提高淡紫擬青霉在田間的定殖與防效是擴大商業化應用的關鍵。
[0003]目前淡紫擬青霉菌劑的生產工藝和設備采用敞開式固體發酵，其缺點在于發酵過程物料含水量及空氣濕度難以控制，且易受雜菌污染，導致發酵失敗，故需要研制出發酵時間短，發酵過程穩定，生產成本低廉的制備方法及適用于該制備方法的裝置。
【發明內容】
[0004]針對以上技術問題，本發明的目的是在于提供了一種淡紫擬青霉菌劑(P.1ilacinus)的制備方法，主要包括最佳的培養基的配方的篩選，以及為了提高淡紫擬青霉的孢子活性，發酵時進行了水分保濕、通氧技術和發酵量的改進，并測試了發酵時間對淡紫擬青霉生長的影響，縮短了發酵時間，降低生產成本。
[0005]本發明的另一個目的是在于提供了一種淡紫擬青霉菌劑的裝置，該裝置結構簡單，使用方便，無需特殊的工藝，只要具備打孔器和普通塑料盤即可，通過此裝置的改進減少了發酵過程中雜菌的污染，保證了發酵中所需要的水分濕度，使得發酵過程更加穩定，降低了生產成本。
[0006]為了實現以上目的，本發明采用如下技術措施:
一種淡紫擬青霉菌劑的制備方法，其步驟是:
(1)制備固體培養基:將硅藻土、玉米粉和水按質量3:3:4混合均勻得到固體培養基，121°C滅菌20-30min，置于無菌處冷卻備用；
(2)發酵:超凈臺里以每200mlPDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養基)種子菌液加入0.5kg固體培養基中，菌液中孢子濃度為1w-1o11Cfu/!!^攪拌均勻后，按厚度2.4-2.6cm裝入容器中，容器封口并通氧(在容器側壁設置孔隙，自然通氧)，在消毒的溫室里進行培養，培養條件:25-28°C，控制濕度為25%-35%，發酵7d_10d得到固體發酵物；
(3)制成顆粒:按照240g固體發酵物+750g硅藻土 +1lOml明膠溶液(冷卻到常溫)的比例混合均勻，用YK-60小型顆粒機制成顆粒(顆粒機中網篩的孔徑為2mm)
所述的明膠溶液的配制方法為:按照75g明膠+935ml水的比例混合，然后加熱至60-80 V攪拌至完全溶解，冷卻到常溫(20-25 0C )。
[0007]所述的消毒溫室采用用甲醛進行消毒，每立方米中將40%甲醛5_8ml與4_8g高錳酸鉀混合，密閉熏蒸30-60分鐘。
[0008]一種淡紫擬青霉菌劑的發酵裝置，包括淺盤、塑料薄膜、橡皮筋、無菌棉球(或者硅膠塞)，淺盤側壁上距盤底邊沿1.5-5cm處設有4-8個孔徑為10_15mm的小孔,小孔內塞入無菌棉球堵住小孔，塑料薄膜覆蓋淺盤的盤口并用橡皮筋箍在淺盤的盤口邊沿密封。
[0009]所述的淺盤的材質為塑料，塑料薄膜的厚度為80 μ m，無菌棉球(或者硅膠塞)孔徑根據打孔大小而定，橡皮筋直徑為0.2-0.5_。
[0010]對比試驗
(I)傳統方法與本發明方法的對比:傳統的固體發酵培養基干培養料質量比為米糠:玉米粉:水=3:3:4，裝入食用菌培養袋，本發明固體發酵培養基干培養料質量比為硅藻土:玉米粉:水=3:3:4，裝入淺盤，兩組均混合均勻，121°C滅菌30min，冷卻后備用，以200mlPDB菌液加0.5kg固體發酵培養基(此操作在超凈臺里進行)，攪拌均勻后，淺盤在消毒的溫室里(用甲醛進行消毒)進行培養，培養條件:28°C，發酵10d。
[0011]試驗結果見圖5，從圖中可以看出將培養基組分中米糠換為硅藻土后，每克發酵物中淡紫擬青霉活孢含量仍可以達到19且與米糠作為培養基組分之間差異不顯著，由于硅藻土比米糠價格低廉，因此在淡紫擬青霉發酵規模化生產中選用硅藻土作為培養基可以降低生產成本。
[0012](2)通氧與未通氧條件的對比:按照本發明方法發酵，淡紫擬青霉發酵過程中一份通氧，一份未通氧，測定每克淡紫擬青霉發酵物中孢子量。
[0013]未通氧的一組采用來規格為45X30X8cm淺盤發酵，通氧的一組將規格為45 X 30 X 8cm淺盤兩邊距底部5cm處用12mm的灼熱的打孔器各打3個小孔，即共打6個小孔，淺盤經過消毒后在超凈臺里面塞上無菌棉球，然后兩組均以200mlPDB淡紫擬青霉發酵液加0.5kg固體發酵培養基比例加入塑料淺盤攪拌均勻后，用薄膜和橡皮筋密封，在消毒的溫室里進行培養，培養條件:28°C，發酵10d，然后調查淡紫擬青霉孢子生長狀況。
[0014]試驗結果見圖6，由圖可知淡紫擬青霉在進行通氧的條件下可以顯著提高孢子活性，可以達到1.23 X 19。
[0015](3)發酵時間的對比:按照本發明方法發酵，淡紫擬青霉發酵設置了 7d、10d、14d，并進行三次重復，測定每克淡紫擬青霉發酵物中孢子量，確定最佳的發酵時間。
[0016]試驗結果見圖7，可以發現在淡紫擬青霉發酵7d、10d、14d淡紫擬青霉孢子量差異不顯著，因此在進行淡紫擬青霉規模化發酵時選擇7d作為發酵時間，可以縮短發酵時間，
提聞了生廣量。
[0017](4)淺盤裝入厚度對比:按照本發明方法發酵,在規格為45X30X8cm淺盤里面分別裝入厚度為2cm、2.5cm、3cm，重復三次，測定每克淡紫擬青霉發酵物中孢子量，確定最佳的裝入量。
[0018]試驗結果見圖8，在規格為45 X 30 X 8的淺盤里裝入厚度為2.5cm待發酵物時與裝入厚度為2cm、3cm之間差異非常顯著，淡紫擬青霉活孢含量達到了 1.79X 109/g，因此在進行淡紫擬青霉小規模發酵時，在淺盤里裝入厚度為2.5cm時待發酵物更加有利于淡紫擬青霉生長。
[0019]本發明與現有技術相比，具有以下優點
1、通過對淡紫擬青霉不同培養基組分進行篩選，在原有培養基米糠+玉米粉+水(3:3:4)組分中，將其中的米糠成分換為硅藻土后，對發酵物中淡紫擬青霉孢子量沒有影響，活孢含量數量級可以保持在109，而且硅藻土方便后期顆粒劑的制備，可以降低生產成本，擴大生產規模。
[0020]2、通過技術的改進，在發酵過程中，為了使淡紫擬青霉能夠更好的生長，在其發酵過程中進行了氧氣供應的改進，在單位空間內，可以提高發酵量。通過在發酵裝置上加蓋薄膜和捆綁橡皮筋保證了菌種生長所需要的濕度，同時還可以防止雜菌污染，使得生產工藝更加優化。
[0021]3、發酵時間和裝入厚度對淡紫擬青霉生長的影響測定中，發現發酵7d、10d、14d淡紫擬青霉孢子活性之間差異不顯著，且數量級保持在109，