改進的內生真菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明通常涉及一種與黑麥玉米（ryecorn)(黑麥（Secale cereale))形成穩定 共生體（共生關系，symbiotic association)的禾本科植物類（內生植物，epichloae)內 生菌。
【背景技術】
[0002] 黑麥（Secale cereale)(俗稱黑麥（Rye))在全球范圍內生長，通常用于生產糧食 (谷物）。糧食主要用于制作面粉、面包和用于直接消費，尤其是在具有黑麥面包消費歷史 的那些國家中。黑麥的營養部分可以被用作稻草，或轉換成青貯飼料，用作動物飼料，包括 用于就地放牧。
[0003] 如上所述，黑麥主要為糧食而生長。因此，在培養過程中需要有效的害蟲防護，以 確保生產足量的質量合格的糧食。黑麥通常被認為是秋季農作物，其中種子一般在秋季播 種。與其它谷物或田地作物的輪種可以用來減少存在于土壤中或在作物碎肩中發展的害蟲 和/或真菌病害的積聚。
[0004] 黑麥的主要害蟲包括但不限于：蚜蟲；牧草蟲；金針蟲和蠐螬；長腳蠅的蛆（大 蚊屬）；麥種蠅（灰地種蠅）；潛葉蟲（潛蠅屬）；瑞典桿蠅（黑麥桿蠅）；地鱉（甲殼蟲 (Zabrus tenebrioides));鞍癭蚊（Haplodiplosis marginata);谷類葉甲蟲（黑角負泥 蟲，0? gallaeciana);線蟲；以及括蝓。
[0005] 用于黑麥的害蟲防治（害蟲控制）的已知方法包括以下做法中的一些或全部：利 用抗害蟲品種，優化種植時間并播種健康種子，有效的輪種，破壞，和/或掩埋或移除作物 碎片（茬）。可能需要的其它害蟲防治方法包括對植物和/或種子使用各種殺蟲劑。有時， 對于害蟲防治可能需要同時施加兩種或更多種活性物質。
[0006] 然而，由于與經常用于這些目的的化學品相關的已知問題，許多殺蟲劑的使用可 能會造成問題。許多殺蟲劑是有毒的，并且可能對處理的農作物的人類和動物消費者造成 危害（Casida和Quistad，1998)。特別是，有毒殺蟲劑在人類和動物體內的積累可能對個體 導致嚴重的健康問題，尤其是在早期發展期間。例如，殺蟲劑暴露已經與呼吸系統疾病、發 育癌癥有關聯，并顯不出對智力能力的發展具有持續影響，Zejda等人，（1993)。
[0007] 可能難以在變化的環境狀況方面控制殺蟲劑的使用，從而導致有毒化合物的不期 望擴散，例如，由于噴霧的漂移或由于土壤淋溶作用。另外，由于許多原因，包括不適當的 做法和處理，害蟲可能發展為殺蟲劑抗藥性的，這可能造成對作物（糧食）產量的真正威 脅。因此，對不使用所應用的殺蟲劑的害蟲防治措施存在需要。
[0008] 本發明的目的是提供至少一種禾本科植物類內生真菌菌株，其在與黑麥屬 (Secale spp.)中的至少一個物種結合時賦予黑麥屬植物至少一定程度的害蟲防護，和/ 或向公眾提供一種有用的選擇。
[0009] 在本說明書中，在參考專利說明書、其它外部文件、或其它來源的信息的情況下， 這通常是為了給討論本發明的特征提供背景的目的。除非另有具體說明，否則參考這樣的 外部文件不應被解釋為承認這些文件或這些信息的來源在任何權限內是現有技術或構成 本領域中公知常識的一部分。
【發明內容】
[0010] 在第一方面，本發明涉及選自由以下組成的組中的禾本科植物類（印ichloae) 內生真菌（真菌內生菌，fungal endophyte)的分離菌株：AR3039 (NRRL#50716)、 AR3046 (NRRL#50576)、AR3049 (NRRL#50577)、AR3050 (NRRL#50578)、AR3064 (NRRL#50718)、 AR3067 (NRRL#50719)、AR3068 (NRRL#50720)、AR3073 (NRRL#50721)、AR3074 (NRRL#50722)、 AR3076(NRRL#50723)和AR3078(NRRL#50724)以及它們的組合。優選地，本發明涉及菌 株 AR3039、AR3046、AR3050、AR3067、AR3068、AR3074 和 AR3078,優選地 AR3046、AR3050 或 AR3068〇
[0011] 在一個實施方式中，分離的菌株在生物學上是純的。
[0012] 在第二方面，本發明涉及一種感染了內生真菌（真菌內生菌）的黑麥屬植物 (Secale spp. plant)，其中，黑麥屬不是內生菌的天然宿主，并且其中，植物和內生菌形成 允許植物經歷正常的生命周期的穩定共生體（symbiotic association)。
[0013] 在一個實施方式中，內生菌通過垂直傳播（vertical transmission)從第一代黑 麥屬傳播給第二代黑麥屬。優選地，從第一代宿主植物到第二代宿主植物的垂直傳播通過 種子進行。
[0014] 在一個實施方式中，內生菌是一種從披堿草屬（Elymus spp.)中分離的內生 菌。優選地，內生菌從批木芙蓉（Elymus mutabilis)中分離。優選地，內生菌是一種禾 本科植物類內生菌（epichloae endophyte)。優選地，禾本科植物類內生菌是選自由以 下組成的組中的禾本科植物類內生菌菌株：AR3039(NRRL#50716)、AR3046(NRRL#50576)、 AR3049 (NRRL#50577)、AR3050 (NRRL#50578)、AR3064 (NRRL#50718)、AR3067 (NRRL#50719)、 AR3068(NRRL#50720)、AR3073(NRRL#50721)、AR3074(NRRL#50722)、AR3076(NRRL#50723)和 AR3078(NRRL#50724)，或者它們的組合。優選地，本發明涉及內生菌菌株AR3039、AR3046、 AR3050、AR3067、AR3068、AR3074 和 AR3078，優選地 AR3046、AR3050 或 AR3068。
[0015] 在一個實施方式中，感染了內生真菌的黑麥屬沒有顯示出內生菌感染的外部癥 狀。
[0016] 在一個實施方式中，感染了內生真菌的黑麥屬顯示出正常的形態表型。
[0017] 在一個實施方式中，感染了內生真菌的黑麥屬產生黑麥草堿生物堿和/或波胺。
[0018] 在一個實施方式中，與未感染內生真菌的黑麥屬相比，感染了內生真菌的黑麥屬 具有對一種或多種害蟲增加的抗性、或對植物病害增加的抗性、或者兩者。
[0019] 在一個實施方式中，感染了內生真菌的黑麥屬具有對一種或多種害蟲增加的抗 性，其中，一種或多種害蟲選自由以下組成的組：⑴以谷溢管姐（Rhopalosiphum padi)、 麥二叉姐（Schizaphis graminum)、玉米姐（Rhopalosiphum maidis)、麥無網長管蟲牙 (Metopoliphium dirhodum)、麥屬(Sitobion spp.)、麥長管蟲牙（Sitobion avenae)、莓 蟲牙（草莓豁網姐，Sitobion fragariae)、麥雙尾姐（俄羅斯小麥姐蟲，Diuraphis noxis) 為代表的姐蟲（姐科）物種；⑵以黑麥桿繩（Oscinella frit)、麥桿繩（Oscinella pusilla)、黑森癭蚊（Mayetiola destructor)、角潛繩屬（Cerodontha spp.)、角潛繩蘆_ (Cerodontha australis)、角潛繩賭螂（Cerodontha angustipennis)、潛繩雖蜂（Formia fumigata)、蘋果麥桿繩（Meromyze americana)、金邊龍蛇蘭鞍癭蚊（Haplodiplosis marginata)、稻稈潛繩（Chlorops pumilionis)、大蚊屬（Tipula spp.)、豌豆側繩（豌豆 潛葉繩，Chromatomyia fuscula)、麥莖蜂（Cephus pygmaeus)、碗豆側繩（Chromatomyia fuscula)、麥黃吸楽蟲（Contarinia tritici)為代表的草和谷物蒼繩（潛繩科；花繩 科、黃潛繩科、莖蜂科和癭蚊科）的物種；⑶以谷泥薊馬（Limothrips cerealium)、齒 角刺鬃薊馬（Limothrips denticornis)、芒缺翅薊馬（Aptinothrips rufus)、禾生枝 孢稻薊馬（Stenothrips graminum)為代表的牧草蟲（薊馬科）物種；（4)以東亞飛蟲皇 (Locusta migratoria)、澳洲蟲皇（Phaulacridium marginale)、卵翅蟲皇（Phaulacridium. Vittatum)、蚱M屬（Melanoplus spp.)、眉紋麟蟀（澳洲黑麟蟀，Teleogryllus commodus) 為代表的蚱蜢和蟋蟀（蝗科和蟋蟀科）物種"5)以麥小長蝽（Nyssius huttoni)、麥 長椿（Blissus leucopertus leucopertus)為代表的蟲子（長椿科）物種；（6)以尖 隱味象屬（Sphenophorus spp.)為代表的象蟲（象鼻蟲）（象甲科）物種；（7)以美洲 粘蟲（Pseudaletia unipuncta)、斜紋夜蛾屬（Spodoptera spp.)、東方粘蟲（Mythimna separata);南方粘蟲（Persectania aversa);翦老虎（Agrostis ipsilon)為代表的粘 蟲和糖蛾（夜蛾科）物種；（8)以黑角負泥蟲（Oulema melanopus)為代表的葉甲（葉甲 科）物種；（9)以日本金龜子（Popillia japonica)、草地賂螬（Costelytra zealandica)、 庭園麗金龜屬（Phyllopertha spp.)、歐洲切根鮑金龜（Rhizotrogus majalis)、錨紋麥穗 金龜甲（Anisoplia segetum)為代表的賂螬（white grub)(金龜子科（Scarabaeidae)) 物種；（10)以球棉粉蟻（Phenacoccus hordei)、早熟禾粉蟻（Balanococcus poae)、 Ripersella rumicis、小麥胭碩蟻（Porphyrophora tritici)為代表的粉蟻（mealybug) (粉蟻科（Pseudococcidae)和介殼蟲科（Coccidae)物種；（11)以寬胸叩頭蟲屬 (Conoderus spp.)、金針蟲屬（Limonius spp.)為代表的金針蟲（wireworms)(叩甲科 (Elateridae))物種；（I2)以玉米距步甲（Zabrus tenebrioides)為代表的甲蟲（beetles) (步甲科（Carabidae))物種；（13)以麥圓蜘蛛屬（Penthaleus spp.)、紅腿土螨（紅足 地螨，Halotydeus destructor)、癭螨屬（Aceria spp.)為代表的螨類（mites)(癭螨科 和葉爪螨科）物種；（14)以米象（Sitophilus oryzae)、谷象（Sitophilus granarius)、 麥蛾（Sitotroga cerealella)、谷蠢（Rhyzopertha dominica)、扁谷盜屬（Cryptolestes spp.)、據谷盜（Oryzaephilus surinamensis)、粉斑螟蛾（Cadra cautella)、印度谷 螟（Plodia interpunctella)、雜擬谷盜（Tribolium confusum)、赤擬谷盜（Tribolium castaneum)、煙草甲（Lasioderma erricorne)為代表的藏物害蟲（stored product pests)(象甲科（Curculionidae)、據谷盜科（Silvanidae)、螟蛾科（Pyralidae)、麥蛾科 (Gelechiidae)、擬步甲科（Tenebrionidae)、長蠢科（Bostrichidae))物種；（15)以長沬 蟲單（Philaenus spumarius)為代表的沬4單（froghopper)(沬4單總科）物種；（16)以根腐 線蟲（root lesion nematode)(根腐線蟲屬（Pratylenchus spp.)，特別是索恩根腐線蟲 (P. thornei)、刻痕短體線蟲（P. crenatus)、落選短體線蟲（P. neglectus)和穿刺短體線 蟲（P. penetrans))、禾谷孢囊線蟲（cereal cyst nematode)(異皮線蟲屬（胞囊線蟲屬， Heterodera spp.)和斑皮線蟲屬（Punctodera spp.)，特別是小麥孢囊線蟲（H.avenae)、 麥類胞囊線蟲（地中海胞囊線蟲，H. latipons)、大麥孢囊線蟲（H. hordecalis)、菲利普孢 囊線蟲（H.filipjevi)、稀少孢囊線蟲（H.mani)、雙膜孔孢囊線蟲（H. bifenestra)、巴基 斯坦孢囊線蟲（H.pakistanensis)和刻點斑皮線蟲（P. punctata))、根結線蟲（root knot nematode)(根結線蟲屬（Meloidogyne spp.)，尤其是奇特伍德根結線蟲（M.chitwoodi)、 納西根結線蟲（禾谷類根結線蟲，M. naasi)、甘藍根結線蟲（M. artiellia)、小頭根結線 蟲（M. microtyla)、奧特森尼根結線蟲（M. ottersoni)、禾谷根結線蟲（禾草根結線蟲， M. graminicola)、禾本科根結線蟲（M. graminis)、菊野根結線蟲（M. kikuyensis)和大米草 根結線蟲（M.spartinae))，莖線蟲病（stem nematode)(莖線蟲屬（Ditylenchus spp.)， 特別是 D. dipsicai 和 D. radicicola);小麥粒線蟲（seed gall nematode)(小麥粒癭線 蟲（Anguina tritici))為代表的線蟲物種；（16)賠蝓（slugs)(網紋野賠蝓（Deroceras reticulatum)和賠蝓屬（Arion spp.)，特別是花園賠蝓（A. hortensis agg.)和微紡錘形 蛞蝓（A. subfuscus))物種。在一個實施方式中，害蟲是線蟲，優選是根腐線蟲（短體線蟲 屬（Pratylenchusspp.))，或潛葉繩，角潛繩（Cerodontha australis)(雙翅目：潛繩科）， 也被稱為麥鞘角潛蠅。
[0020] 在一個實施方式中，感染了內生真菌的黑麥屬具有對植物疾病增加的抗性，其 中植物疾病由選自由以下組成的組中的植物病原體引起：大麥黃矮病毒（Leteovirus)、 小麥土傳花葉病毒（真菌傳桿狀病毒（Furovirus))和小麥線條花葉病毒（小麥花葉 病毒屬（Tritimovirus))，野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)、丁香假單胞菌 (Pseudomonas syringae)、草坪炭疽菌（禾生炭疽菌，Colletotrichum graminicola)、蘋 果炭疽菌（Glomerella graminicola)[有性型]、鏈格孢屬（Alternaria spp.)、草本枝 抱（Cladosporium herbarum)、塔森球腔菌（Mycosphaerella tassiana)[有性型]、附球 菌屬（Epicoccum spp.)、擲抱酵母屬（Sporobolomyces spp.)、匍柄霉屬（Stemphylium spp.)、麥根腐平臍懦孢（Bipolaris sorokiniana)、禾旋孢腔菌（Cochliobolus sativus) [有性型]、鐮刀菌屬（Fusarium spp.)、小麥網腥黑穗病菌（Tilletia caries)、小麥腥 黑穆病（Tilletia tritici)、腥蟾（Tilletia laevis)、腥黑粉菌（Tilletia foetida)、 禾谷黑膜座菌（Hymenula cerealis)、禾谷頭孢霉（麥類條斑病菌，Cephalosporium gramineum)、麥根腐長懦抱（Helminthosporium sativum)、禾旋抱腔菌（Cochliobolus sativus)[有性型]、胡和鬼傘菌（Coprinus sychromorbidus)、看麥娘雙極毛孢 (Dilophospora alopecuri)、小麥矮化腥黑穗病菌（Tilletia controversa)、紫瘢麥角 菌（Claviceps purpurea)、麥角蜜孢菌（Sphacelia segetum)[無性型]、大刀鐮刀菌 (Fusarium culmorum)、假冰草殼抱（Pseudoseptoria donacis)、禾谷類暈斑病菌（小 麥白稈病，Selenophoma donacis)、印度尾孢黑粉菌（Neovossia indica)、小麥印度腥 黑穗病（Tilletia indica)、隱匿柄銹菌（小麥葉銹病，Puccinia recondita)、孢銹菌 (Aecidium clematidis)[無性型]、草坪褐條斑病（Cercosporidium graminis)、禾單隔 抱（Scolicotrichum graminis)、小麥葉枯病菌（Phaeosphaeria herpotrichoides)、小 球腔菌屬病菌（Leptosphaeria herpotrichoides)、小麥散黑穆病（Ustilago tritici)、 微座孢屬斑病（Microdochium nivale)、雪腐鐮孢（Fusarium nivale)、小麥雪霉病 (Monographella nivalis)[有性型]、麥類白粉菌（Erysiphe graminis)、瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum)、強雄腐霉（Pythium arrhenomanes)、德巴利腐霉（Pythium debaryanum)、禾生腐霉（Pythium graminicola)、終極腐霉（Pythium ultimum)、玉蜀 黍赤霉（Gibberella zeae)、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum)[無性型]、黑麥殼 針抱（Septoria secalis)、小麥殼針抱（Septoria tritici)、葉枯菌（Mycosphaerella graminicola)[有性型]、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis)、立枯絲核菌 (Rhizoctonia solani)、玉蜀泰絲核菌（Rhizoctonia zeae)、白粉菌屬（Blumeria spp.)、 小麥紋枯病（Ceratobasidium cereale)[有性型]、雪腐大粒菌核病（Myriosclerotinia borealis)、白霉病菌（Sclerotinia borealis)、小麥雪腐病（Typhula idahoensis)、雪霉 病（Typhula incarnate)、雪腐病核瑚菌（Typhula ishikariensis)、雪腐病核瑚菌變種黃 花（Typhula ishikariensis var. canadensis)、穎枯殼針抱（Stagonospora nodorum)、狗 牙根殼針孢（Septoria nodorum)、菜豆褐斑病菌（Phaeosphaeria nodorum)[有性型]、 穎枯小球腔菌（Leptosphaeria nodorum)、隱條黑粉菌（Urocystis occulta)、桿銹菌 (Puccinia graminis)、黃曲霉屬（Aspergillus spp.)、球黑抱霉屬（Nigrospora spp.)、青 霉屬（Penicillium spp.)、根霉屬（Rhizopus spp.)、小麥基腐病菌（Pseudocercosporella herpotrichoides)、塔普斯梭狀芽胞桿菌（Tapesia acuformis)[有性型]、條銹病 (Uredo glumarum)[無性型]、小麥黃斑病真菌（Pyrenophora tritici-repentis)、小麥 德氏霉（Drechslera tritici-repentis)[無性型]、殼針抱葉枯病（Helminthosporium tritici-repentis)、小麥葉銹菌（Puccinia triticina)、腐霉屬（Pythium spp.)、大麥云 紋病菌（Rhynchosporium secalis)、小麥條銹病（Puccinia striiformis)、小麥全蝕病菌 (Gaeumannomyces graminis)和小麥冠腐病菌（Fusarium pseudograminearum) 〇
[0021] 優選地，植物病原體是隱匿柄銹菌（Puccinia recondita)、小麥葉銹菌（Puccinia triticina)、桿銹菌（Puccinia graminis)、鏡刀菌屬（Fusarium spp.)、腐霉屬（Pythium spp.)、大麥云紋病菌（Rhynchosporium secalis)、小麥條銹病（條銹菌，Puccinia striiformis)、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis)、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)或小麥冠腐病菌（假禾谷鐮刀菌，Fusarium pseudograminearum) 在一個實施方 式中，感染了內生真菌的黑麥屬選自由以下組成的組：黑麥（普通黑麥，Secale cereale)、 山黑麥（Secale montanum)、山地黑麥（Secale strictum)、森林黑麥（Secale sylvestre) 和瓦維洛夫黑麥（Secale vavilovii)。優選地，黑麥屬是黑麥（普通黑麥）
[0022] 在第三方面，本發明涉及一種制備穩定的宿主植物/禾本科植物類內生真菌組合 的方法，包括使用與接種植物形成穩定組合的至少一種內生真菌來人工地感染黑麥屬植 物，其中所述宿主植物沒有顯示出內生菌感染的外部癥狀。
[0023] 在一個實施方式中，穩定的植物/真菌組合是足夠穩定的以允許內生菌的垂直傳 播（vertical transmission) ?在一個實施方式中，垂直傳播通過分蘗（tiller)進行，特別 是通過花的分蘗進入種子，或者通過繁殖進行。優選地，從第一代宿主植物到第二代宿主植 物的垂直傳播通過種子進行。
[0024] 在一個實施方式中，內生菌的垂直傳播導致內生菌從第一代到第二代