一種繁育馬尾松優良群體無性化組培苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬植物繁殖技術領域，涉及組織培養育苗技術，尤其是一種繁育馬尾松優良群體無性化組培苗的方法。
【背景技術】
[0002]馬尾艙iPinus原產我國，是我國南方重要的荒山綠化、造紙原料林和采脂林、自然風景林的重要樹種之一，在我國分布范圍極為廣闊。作為一種綜合利用價值高、推廣潛力大的樹種，馬尾松不僅可用來生產三板、造紙及化纖工業制造，還可用來生產松香、松節油等工業原料。近年來，隨著人們日益增長的生活需求與木材資源短缺和石油等不可再生資源逐漸枯竭等矛盾的激化，生態、經濟和社會的可持續發展越來越受到社會關注。基于我國生態安生、資源安全與社會安全等問題，馬尾松作為我國主要的工業用材樹種和生物質能源樹種之一，大力發展馬尾松人工林很有必要。
[0003]我國自“六五”國家科技攻關以來，在馬尾松良種選育和速生豐產栽培技術等方面取得了較大突破。目前，馬尾松良種主要以種子園和母樹林的有性繁殖為主。然而，有性繁殖存在著遺傳分化的問題，不能最大限度地提高遺傳改良增益，而無性繁殖卻能克服有性繁殖的上述不足。
[0004]體胚發生及器官發生是目前全世界最為常用的兩種無性組培技術途徑。其中，體胚發生技術含量高，繁殖速度快，其主要是以未成熟合子胚為外植體，通過系列的體胚培養技術培育無性體胚苗，該技術能在較短時間內獲得大量苗木，但由于體胚苗根系發育較弱，且其生長對氮含量要求較高，因此對環境的適應能力較差，成活率不高。器官發生技術較易掌握，在生產上較為常用，其中“以芽繁芽”組培快繁方式尤為常見，該技術培育苗木根系發達，芽苗健壯，環境適應性強，但由于其繁殖倍數較低，繼代周期長，生產成本偏高。
[0005]馬尾松屬組織培養困難的樹種。國內眾多學者對馬尾松體胚發生及器官發生技術進行了大量的研究，其中馬尾松體胚發生技術主要集中在體胚誘導、增殖與成熟培養方面研究，就體胚萌發及轉化方面的明顯成效仍鮮少見，其原因主要在于體胚苗萌發及轉化率不高，根系質量差，得苗率偏低，技術應用性不強。而通過器官發生途徑的馬尾松組培快繁技術，由于繼代芽增殖系數偏低，培育周期長，嚴重制約了馬尾松組培苗的快速繁育。
【發明內容】
[0006]本發明的目的主要針對馬尾松體胚苗萌發率低、根系質量差，通過器官發生途徑的馬尾松組培繁殖效率低、繼代培養周期長等現狀，為解決馬尾松良種匱乏，實現馬尾松優良群體無性化組培苗廣泛推廣應用，提供一種繁育馬尾松優良群體無性化組培苗的方法。
[0007]本發明是這樣實現的：
一種繁育馬尾松優良群體無性化組培苗的方法，包括體胚萌發、體胚苗伸長、增殖培養、叢芽伸長和生根培養的工序，將發育成熟的馬尾松體細胞胚置于萌發培養基，萌發成芽苗后轉入伸長培養基進行培養，待芽苗伸長后，切掉根系轉入增殖培養基進行叢芽誘導，將誘導叢芽轉入伸長培養基進行伸長，待芽苗達3-5 cm高時，將芽苗單個切下置于生根培養基中進行生根處理，獲得馬尾松優良群體組培生根苗，其操作步驟如下:
(1)體胚萌發:將白色不透明，具有蠟質光澤，并發育成子葉期的成熟馬尾松體細胞胚置于萌發培養基中進行萌發；
(2)體胚苗伸長:待萌發體胚苗葉片轉綠，下胚軸基部變紅，根莖葉分化后，轉至伸長培養基中進行伸長培養；
(3)增殖培養:體胚苗伸長至3-5cm高時，將體胚苗切去根系后直接放入增殖培養基中進行叢芽誘導；
(4)叢芽伸長:將誘導出的叢芽轉入伸長培養基進行伸長培養；
(5)生根培養:單個切下生長健壯、半木質化、高2-3cm的馬尾松芽苗，接種在生根培養基中，進行生根培養，獲得馬尾松優良群體組培生根苗。
[0008]以上所述的萌發培養基其原料含量為:活性炭10 g.L \葡萄糖20 g.L \乳糖5g.L \蔗糖5 g.L 1和1/2改良MS培養基。
[0009]以上所述的伸長培養基其原料含量為:活性炭5 g.L \蔗糖30 g.L 1和改良MS
培養基。
[0010]以上所述的增殖培養基其原料含量為:6-BA 0-1.0 mg.L \噻苯隆(TDZ)1.0-3.0 mg.L \ Meta-Topolin (MT) 1.0-2.0 mg.L \蔗糖 30 g.L 1 和改良 MS 培養基。
[0011]以上所述的生根培養基其原料含量為:ABT6 1.0-2.0 mg.L \ IAA 0.5-1.0mg.L \椰子汁10 mL.L \活性炭1.0-2.5 g.L \蔗糖10 g.L 1和1/2改良MS培養基。
[0012]以上所述的改良MS培養基的基本組成為=KNO3 1050 mg *L SNH4NO3 850 mg *L SCaCl2.2Η20 260 mg.L ^MgSO 4.7H20 370 mg.L SCa (NO 3) 2.4H20 600 mg.L SKH2PO4 340mg *L SMnSO 4.H2O 22.3 mg *L SZnSO 4.7Η20 8.6 mg.L SCuSO 4.5Η20 0.025 mg *L 3B036.2 mg.L SNa 2Mo04.2H20 0.025 mg.L SKI 0.83 mg.L SCoCl 2.6H20 0.025 mg.L S維生素B1 1.0 mg.L S維生素B6 0.5 mg.L S煙酸0.5 mg.L S甘氨酸2.0 mg.L S肌醇 100 mg.L 1 ο
[0013]以上步驟(I)所述的體胚萌發的培育控制條件為:暗培養、無光照，培養溫度20±1°C;步驟(2)所述的體胚苗伸長、步驟(3)所述的增殖培養、步驟(4)所述的叢芽伸長、步驟(5)所述的生根培養的培育控制條件均為:光培養，光照1500-2000 lx，每日光照16h，培養溫度20-28 °C。
[0014]本發明相對于現有的技術具有以下優點:
1、本發明創建了體胚發生與器官發生相融合的一種高效培育馬尾松優良群體無性化組培苗的繁育技術，能迅速、高效地獲取大量優質馬尾松優良群體組培苗，有效解決了體胚發生中體胚苗根系較弱、生長差以及器官發生中芽苗增殖率低、繁殖周期長等問題，具有顯著的創新性和進步性。
[0015]2、通過本發明技術，馬尾松體胚苗萌發率高達97%以上，通過器官發生途徑的生根培養，生根率達95%，且根系發達，芽苗健壯、活力旺盛，成活率高，苗木培育周期明顯縮短，效果顯著，解決馬尾松良種匱乏的問題，實現馬尾松優良群體無性化組培苗廣泛推廣應用，具有較好的經濟效益和社會效益。
【附圖說明】
[0016]圖1為活力旺盛的馬尾松胚性細胞系。
[0017]圖2為馬尾松胚性細胞系經成熟培養后形成的體細胞胚。
[0018]圖3為經體胚萌發后產生的馬尾松體胚苗。
[0019]圖4為經生根培養后形成的馬尾松組培生根苗。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0021]實施例1:
一種繁育馬尾松優良群體無性化組培苗的方法，以馬尾松優良家系未成熟子葉前期合子胚為外植體，通過體胚發生獲取了大量活力旺盛馬尾松胚性細胞系。其中，將胚性細胞系SE-3經成熟培養后產生的白色不透明，具有蠟質光澤，且發育成子葉期的成熟體細胞胚置于萌發培養基進行萌發；所述的萌發培養基為:1/2改良MS培養基+活性炭10 g.L k葡萄糖20 g.L 4乳糖5 g.L 4蔗糖5 g-L'o培育控制條件為:暗培養、無光照，培養溫度20±1°C。培養I周，萌發率達97.4%。
[0022]待萌發體胚苗葉片轉綠，下胚軸基部變紅，根莖葉分化后，轉至伸長培養基中進行體胚苗伸長培養；所述的伸長培養基為:改良MS培養基+活性炭5 g *L k蔗糖30 g-L'o培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。
[0023]伸長培養40天后，體胚苗伸長至3-5 cm高時，將體胚苗切去根系后直接放入增殖培養基中進行叢芽誘導增殖培養；所述的增殖培養基為:改良MS培養基+噻苯隆(TDZ)2.0mg.L 1+Meta-Topolin (MT) 1.5 mg.L '+蔗糖30 g.L、培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。
[0024]增殖培養30天，將誘導出的叢芽轉入上述所述的伸長培養基中進行叢芽伸長培養。培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。
[0025]伸長培養45天，單個切下生長健壯、半木質化、高2-3cm的芽苗，接種在生根培養基中，進行生根培養；所述的生根培養基為1/2改良MS培養基+ABT6 1.0 mg.L '+IAA 1.0mg.L '+椰子汁10 mL.L '+活性炭1.0 g.L k蔗糖10 g.L ^培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。生根培養28天，生根率達93%。
[0026]以上所述的改良MS培養基的基本組成為=KNO3 1050 mg *L SNH4NO3 850 mg *L SCaCl2.2Η20 260 mg.L ^MgSO 4.7H20 370 mg.L SCa (NO 3) 2.4H20 600 mg.L SKH2PO4 340mg *L SMnSO 4.H2O 22.3 mg *L SZnSO 4.7Η20 8.6 mg.L SCuSO 4.5Η20 0.025 mg *L 3B036.2 mg.L SNa 2Mo04.2H20 0.025 mg.L SKI 0.83 mg.L SCoCl 2.6H20 0.025 mg.L S維生素B1 1.0 mg.L S維生素B6 0.5 mg.L S煙酸0.5 mg.L S甘氨酸2.0 mg.L S肌醇 100 mg.L 1 ο
[0027]實施例2:
一種繁育馬尾松優良群體無性化組培苗的方法，以馬尾松優良家系未成熟子葉前期合子胚為外植體，通過體胚發生獲取了大量活力旺盛馬尾松胚性細胞系。其中，將胚性細胞系SE-3經成熟培養后產生的白色不透明，具有蠟質光澤，且發育成子葉期的成熟體細胞胚置于萌發培養基進行萌發；所述的萌發培養基為:1/2改良MS培養基+活性炭10 g.L k葡萄糖20 g.L k乳糖5 g.L 4蔗糖5 g-L'o培育控制條件為:暗培養、無光照，培養溫度20±1°C。培養2周，萌發率達98.1%。
[0028]待萌發體胚苗葉片轉綠，下胚軸基部變紅，根莖葉分化后，轉至伸長培養基中進行體胚苗伸長培養；所述的伸長培養基為:改良MS培養基+活性炭5 g *L k蔗糖30 g-L'o培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。
[0029]伸長培養40天體胚苗伸長至3-5 cm高時，將體胚苗切去根系后直接放入增殖培養基中進行叢芽誘導增殖培養；所述的增殖培養基為:改良MS培養基+6-BA 0.5 mg - L噻苯隆(TDZ) 1.5 mg.L ^Meta-Topolin (MT) 2.0 mg.L k 鹿糖 30 g.L1。培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。
[0030]增殖培養25天，將誘導出的叢芽轉入上述所述的伸長培養基中進行叢芽伸長培養。培育控制條件均為:光培養，光照1500 lx，每日光照16 h，培養溫度20-28°C。
[0031]伸長培養45天，單個切下生長健壯、半木質化、高2-3c