鐵皮石斛組培快繁方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鐵皮石斛組培快繁方法。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛(學名:Dendrobiumofficinale)，又稱黑節草，屬于氣生蘭科草本植物附生蘭類，石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數十種，鐵皮石斛為石斛之極品，它因表皮呈鐵綠色而得名。野生鐵皮石斛只生長在懸崖峭壁上的陰面崖縫間或者原始森林的大樹上，且對溫度、濕度、光照等小氣候的要求近乎苛刻，每年植株只分枝一次，長約一寸，至少要2-3年才能采收。是傳統的名貴中藥材，《本草綱目拾遺》中說石斛“清胃除虛熱、生津，已勞損。以之代茶，開胃健脾。在臨床上，石斛多用于治療陰傷津虧、口干煩渴、食少干嘔、病后虛熱，以及目暗不明等癥。
[0003]鐵皮石斛的種子極細小，胚胎發育不完全，無胚乳組織，在自然狀態下發芽率極低。加之長期以來掠奪性的采挖，致使野生的鐵皮石斛資源已近枯竭，處于瀕危狀態。現仍存在種源混亂，種植技術參差不齊，規范化水平低，仿野生種植面積小，產品質量難以保證。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是公開一種鐵皮石斛組培快繁方法，以解決鐵皮石斛種苗的問題，為發展鐵皮石斛的人工種植提供基礎條件。
[0005]鐵皮石斛組培快繁方法，包括初代培養、繼代培養、生根壯苗培養，具體步驟如下:
一、初代培養:
(1)、種子培養
a、果實采集，8?9月份采集成熟沒有裂開的蒴果；
b、滅菌，在無菌工作臺內進行表面滅菌，用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分鐘，無菌水沖洗6次；
c、播種，用無菌濾紙吸去蒴果表面水分、切開果皮，將粉末狀種子均勻播撒在培養基表面或將種子直接撒在無菌水中搖勻，再用無菌吸管取此混合液置于無菌培養基上；
d、培養條件，光照強度為1600?2000LX，光照時間10h/d，培養溫度25±2°C；
(2)、莖尖、幼莖培養:
a、莖尖或幼莖采集，選擇長勢、性狀良好，無病蟲的莖尖或帶腋芽的幼莖，，用自來水沖洗、洗滌劑洗凈；
b、滅菌，在無菌工作臺內用70%的酒精浸泡30秒鐘，再用0.1%升汞溶液浸泡15分鐘，之后用無菌水沖洗至少6次；
C、接種，將滅菌的莖尖用無菌濾紙吸去表面水分，并切割成3?5mm長并帶有一個節的莖段，接種到誘導培養基上；
(3)、原球莖、側芽誘導 a、兩種培養基
A: 1/2MS+BA0.2 ?0.5mg/L+NAA2 ?0.5mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 5% ；
B: l/2MS+6_BAlmg/L+NAA0.2mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 5%，pH 值為 5.8 ；
b、誘導步驟:1、莖尖、莖段接種到培養基A上進行側芽的誘導，當誘導側芽長成球型時，切去鱗片狀葉被和周圍變褐組織；?、或將新發的枝切割，反復培養，接種到B培養基上進行原球莖的誘導；ii1、60天后將原球莖分割成小塊繼續轉接到B培養基上，以后每50?60天繼代一次，使原球莖不斷增殖；
二、鐵皮石斛繼代培養
(1)、將初代培養中獲得的原球莖或芽轉接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/ L+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培養基上反復轉接培養；反復轉接的次數由需要的苗量決定；
(2)、接種時按照苗的生長情況，依大、中、小分類轉接，培養瓶接種的數量因容器大小而定；
(3)40?60天轉接一次；
(4)培養條件:溫度25?27°C，光照8?10h/d光照強度1600?2000LX。
[0006]三、生根壯苗培養:
(1)、培養基，1/2MS++NAA0.2mg/ L +6_ΒΙΒΑ0.2mg/ L++ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 10%+ 糖7.5%，pH 值為 5.8 ；
(2)、接種，將繼代培養中高度2?3cm小苗分離成單株，接種到前述生根培養基上；
(3)、培養條件，光照時間10?12h/d，光照強度:前兩個月1600?2000LX、以后4000LX，培養溫度25±2°C;當生根苗具有5?6片展葉，高度達6cm，根系正常時即可出瓶供移栽訓化；
(4)、生根苗煉苗訓化:
a、煉苗基質選擇，用純松樹皮，規格大小為0.5X0.5cm,經消毒、并噴水充分濕潤、發酵制得，即采用2000倍多菌靈藥液浸泡24小時，然后堆捂發酵2?3個月，做到手握成團松手即散。
[0007]b、移栽定植，采用消毒的穴盤定植，移栽深度控制在不埋到苗的基部。
[0008]C、移栽定植后管理，移栽定植后，澆透定根水，用遮光網遮光80%并根據空氣溫濕度，葉面噴霧，防止葉面脫水，7天后，以葉面不被灼傷為度，逐步增強光照；白天棚內保持27°C，夜間不低于15°C，15天后遮光70%，并補水防止干燥；每周用75%的百菌清600倍液噴霧一次，防病保苗。
[0009]d、病蟲害防治，搞好大棚的溫度濕度調控及通風透氣工作，相對濕度控制在60%?65%，溫度控制在20°C?30 °C ;對黑腐病、炭疽病，用75%的百菌清600倍液或25%瑞霉素600倍液，連續噴2?3次，間隔7?10天；在苗床周圍撒生石灰防治蝸牛。
[0010]所述的胚培養方法中在培養基上播種方式是:成熟的種子播種于1/2MS+馬鈴薯泥5%的培養基上；未成熟的種子，在培養基中添加外源激素即細胞分裂素、生長素再播種，或播在1/2MS+NAA00.2mg/L+糖2%+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%的培養基上。
[0011]所述生根苗煉苗訓化步驟中還需對種苗消毒、穴盤消毒、苗床消毒，種苗消毒采用2000倍多菌靈藥液浸泡10分鐘，穴盤播種前必須清洗干凈，后采用0.1%高錳酸鉀藥液進行消毒；苗床在每育一批種苗后都須采用2000倍多菌靈藥液噴濕透，反復2 — 3次消毒處理。
[0012]采用初代培養、繼代培養(增殖培養)、生根壯苗培養三段式培養步驟，即初代培養將鐵皮石斛種子在種子培養基中培養形成原球莖并進一步形成小芽，接著把鐵皮石斛小芽轉接于繼代培養基中培養成具有2?3片真葉并帶有I?2條幼根的小苗，再將小苗轉移到生根壯苗培養基中培養成具有2?3條根、4片葉片、株高多2.5cm、莖粗多0.2cm的商品組培苗，然后將商品組培苗移栽至大棚內苗床上的基質中并培養至可采收。
[0013]通過實施本發明，種子萌發率高，芽苗生產快、污染低，商品組培苗粗壯、葉面展開、根系發達、成活率高；從而實現鐵皮石斛種苗快速無毒繁育的目的，解決種苗稀缺難題。為推廣栽培提供有力的科學依據和指導，使瀕危鐵皮石斛資源得到合理開發利用。
【具體實施方式】
[0014]以下作為本發明的實施例，對技術方案作進一步說明。
[0015]一、鐵皮石斛初代培養:這是整個培養過程的基礎，其目的是對外植體進行表面滅菌、建立無菌體系，這一階段的效果依外植體的滅菌方法、接種操作手段以及培養基的成分而異。鐵皮石斛無菌繁殖體系的建立，可通過兩種方法(蒴果、莖尖或莖段)來實現。
[0016]1.種子(胚)培養，鐵皮石斛的果實為蒴果、內部含有極多粉塵細小的種子(10?30萬粒甚至更多)，種子發育不全僅有一個簡單的胚、缺少胚乳組織，自然條件下種子不發芽或發芽率極低。a、果實采集，8?9月份采集成熟種子，還沒有裂開的蒴果。這時蒴果內的種子相互分離容易播種、滅菌，可只對蒴果進行表面滅菌即可。b、滅菌，去除蒴果宿存的花被、果柄，在無菌工作臺內進行表面滅菌。用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分鐘，無菌水沖洗6次。C、播種，用無菌濾紙吸去蒴果表面水分、切開果皮，將粉末狀種子均勻播撒在培養基表面或將種子直接撒在一定量的無菌水中搖勻，然后用無菌吸管取此混合液于無菌培養基上(此方法播種較均勻、出苗較整齊)。d、培養基，成熟的種子播種于1/2MS+馬鈴薯泥5%的培養基上，不需要添加外源激素。未成熟的種子，培養基需要添加外源激素，可播在1/2MS+NAA00.2mg/L+糖2%+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%的培養基上。e、培養條件，光照強度為1600?2000LX，光照時間10h/d，培養溫度25±2°C。培養15?20天種子由黃色轉綠、呈球形增大，基部有絲狀毛的原球莖；50?60天長出大量的原球莖及分化出小苗。溫度在25?27°C之間時，種子萌發生長較快；當溫度低于15°C時，即使滿足營養條件萌發率也較低；當溫蒂在23?25°C時原球莖生長良好、增殖較快。
[0017]2、莖尖、幼莖培養，利用莖尖或幼嫩的帶腋芽的莖段為繁殖材料進行培養。種苗可較好保持母株性狀、生長整齊、長勢旺、易于標準化生產，對新品種的選育和擴繁是非常有效的方法；但技術要求高、周期長、成本高、難度大，選擇適宜的培養基及其方法至關重要。a、外植體(莖尖或幼莖)采集，選擇長勢、性狀良好，無病蟲的莖尖或帶腋芽的幼莖，去除不要的葉、葉鞘等，用自來水沖洗、洗滌劑洗凈，所述洗滌劑為餐具或水果用的洗滌用品。b、滅菌，在無菌工作臺內用70%的酒精浸泡30秒鐘，再用0.1%升汞溶液浸泡15分鐘，之后用無菌水沖洗6次。C、接種，將滅菌的外植體用無菌濾紙吸去表面水分，并切割成3_5mm長帶有一個節的莖段接種到誘導培養基上。
[0018]3、原球莖、側芽誘導，A: 1/2MS+BA0.2_0.5mg/L+NAA2_0.5mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥5%+ 香蕉泥 5%。B: l/2MS+6_BAlmg/L+NAA0.2mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 5%，pH 值為5.8 ;莖尖、莖段接種到培養基A上進行側芽的誘導，當誘導側芽長成球型時，切去鱗片狀葉被和周圍變褐組織；也可以將新發的枝切割，反復培養，接種到B培養基上進行原球莖的誘導。60天后將原球莖分割成小塊繼續轉接到B培養基上，以后每50?60天繼代一次，使原球莖不斷增殖。原球莖不經切割在誘導培養基B上培養60天左右，不定芽會逐漸產生，最后發育成帶葉幼芽。
[0019]低濃度糖(2%)比較適合分化生長。培養條件:光照強度為1600?2000LX，光照時間10h/d,培養溫度25±2°C。
[0020]二、鐵皮石斛繼代培養(增殖培養):這一階段培養目的是繁殖大量有效的芽尖或幼苗，使之數量擴大，迅速獲得大量的無菌繁殖體系，達到組培快繁目的。1、將初代培養中獲得的原球莖或芽轉接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/ L+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培養基上反復轉接培養，母瓶轉接的數量依生產規模、生產計劃而定。2、接種時按照苗的生長情況，依大、中、小分類轉接，培養瓶接種的數量因容器大小而定，疏密適中均勻，大小要一致。3、40?60天