一種文冠果豐產營林的分子設計方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及通過分子識別設計文冠果的營林格局，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 文冠果屬無患子科文冠果屬，是我國特有的落葉小喬木或灌木，1屬1種。昆蟲 傳粉的文冠果花為雌雄同株，雄花的雌蕊退化，雌花的花粉囊不開裂。文冠果坐果率非常 低，通常小于5 %，在果樹中非常罕見，故稱"千花一果"，其主要原因是文冠果存在自交不 親和的現象。發明人進行控制授粉試驗，對比研究結果表明，文冠果自交結實率為〇%、同 株異花授粉結實率為2. 79%、開放授粉結實率為9. 47%、異花授粉結實率為17. 97% ;而 文冠果花大而多，昆蟲傳粉的傳粉方式易造成同花自交授粉和同株異花授粉。為解決"千 花一果"問題，我國學者在文冠果傳粉（田英等，黑龍江農業科學，2013,（6) :50-55)、開 花結實（郭冬梅等，北方園藝，2013,（6) :21-23)、落花落果（柴春山等，植物研究，2012， 32(1): 110-114)、雄花雌蕊敗育、雌花雄性不育的蛋白和基因表達、激素調控花性別與保花 保果（汪智軍等，吉林農業科學，2013, 38 (1) : 58-61)、優良無性系選擇等方面開展了大量 研究，并取得了一定進展，如文冠一號、文冠二號、文冠三號、文冠四號、中淳一號和中淳二 號等優良品種的選育。但未見利用文冠果的自交敗育機制獲得自交恢復系以提高文冠果產 量的報道。
[0003] 到目前為止，未見利用Nei氏遺傳距離與花粉流設計高異交傳粉配置格局的豐產 營林技術的相關專利。
【發明內容】
[0004] 針對上述問題，本發明以不同文冠果種質為材料，根據不同種質間的Nei氏遺傳 距離設計不同的授粉組合，并根據不同授粉組合的結實率和坐果率優選出最適種質組合， 再以高異交傳粉配置格局設計營造豐產林，實現文冠果產量提高，為文冠果產業提供技術 依托。本發明的技術方案如下：一種文冠果豐產營林的分子設計方法，由以下順序的步驟組 成：
[0005] (1)選擇不同文冠果種質，分別提取其DNA ;
[0006] (2)篩選適用于文冠果的SSR標記引物；
[0007] (3)利用篩選出的SSR標記引物，計算不同文冠果種質間的Nei氏遺傳距離；
[0008] (4)將Nei氏遺傳距離劃分為8個級別，在每個級別內，以不同文冠果種質互為授 粉樹，設計不同的授粉組合，分別進行人工授粉；
[0009] (5)在人工授粉后的第20天統計并計算結實率，第60天統計并計算坐果率；得到 配合力最佳的文冠果種質；
[0010] (6)以步驟（5)得到的配合力最佳的文冠果種質為材料，設計文冠果豐產營林模 式。
[0011] 進一步的，所述步驟（1)提取DNA的方法為改良CTAB法。
[0012] 進一步的，所述步驟（2)篩選SSR標記引物的方法包括如下步驟：
[0013] 1)利用RNA-Seq技術開發文冠果的SSR標記序列；
[0014] 2)采用Primer Premier 5. 0軟件設計特異引物：參數為：引物長度（20~24nt)、 3'端穩定性（-6. 0~-9. Okal/mol)、引物Tm值（55~60°C )、GC含量（45~55% )、引物 rating值> 90。以不同文冠果種質的DNA為模板，進行PCR擴增，根據聚丙烯酰胺垂直凝 膠電泳結果，篩選出SSR標記引物。
[0015] 進一步的，所述步驟（6)文冠果豐產營林模式，文冠果的株行距為ImXL 5m，種質 組合間的Nei氏遺傳距離范圍為0. 36-0. 40。
[0016] 本發明根據利用SSR標記檢測不同文冠果種質間的Nei氏遺傳距離選配出最適的 授粉組合：Nei氏遺傳距離為0. 36-0. 40的種質授粉組合為最佳，異交授粉的結實率和坐果 率分別達87%和63%以上，以高異交傳粉配置格局成功實現文冠果豐產營林模式，為我國 大面積建設文冠果經濟能源林，發展文冠果產業提供了豐產營林的技術基礎。
[0017] 本發明的有益效果如下：
[0018] (1)本發明的分子識別方法操作簡單，易推廣擴大使用；
[0019] (2)使用本發明方法提供的分子識別方法，篩選出Nei氏遺傳距離范圍0. 36-0. 40 的授粉組合為最佳，異交授粉的結實率和坐果率分別達87%和63%以上，極大的提高了文 冠果的結實率和坐果率，解決了文冠果千花一果的問題；
[0020] (3)本發明提供文冠果豐產營林模式，為我國大面積建設文冠果經濟能源林，發展 文冠果產業提供了豐產營林的技術基礎。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但這不限制本發明的范圍，實施例以 阜蒙和通遼文冠果種質基地的6個文冠果品種和50個文冠果優良無性系為材料。文冠果 品種分別為：文冠 1號、文冠 2號、文冠3號、文冠4號、中淳1號和中淳2號；優良無性系分 別為：FM1、FM2、FM4、FM5、FM6、FM7、FM8、FM10、FM12、FM13、FM14、FM15、FM16、FM17、FM19、 FM21、FM22、FM23、FM24、FM25、FM26、FM27、FM28、FM29、FM33、FM36、FM37、FM40、FM41、FM43、 FM48、FM50。NaAc 溶液的濃度為 3mol/L，PH 為 5. 2。
[0022] 實施例1
[0023] -、選擇最佳的文冠果授粉組合
[0024] (1)以6個文冠果品種和50個文冠果優良無性系為材料，利用改良CTAB方法分別 提取其DNA，步驟如下：
[0025] 1)將文冠果葉片10克放入研缽，倒入適量液氮研磨后，移入預先加有700 μ L 2XCTAB的離心管中，置于65°C水浴處理45~60min，離心（4°C，lOOOrpm，IOmin)得上清 液I ;
[0026] 2)取步驟1)離心管中上清液I 600 μ L于新離心管中，加入總體積為600 μ L的 酸、氯仿和異戊醇混合液（體積比為25 :24 :1)，搖勾后離心（4°C，lOOOrpm，IOmin)得上清 液II ;
[0027] 3)取上清液II 550 μ L于離心管中，加入500 μ L 10XCTAB，搖勻后置于65°C水浴 中溶解2~3min，再加入總體積為50 μ L的酸：氯仿：異戊醇混合液（體積比為25 :24 :1)， 搖勾后離心（4°C，lOOOrpm，IOmin)，得上清液III ;
[0028] 4)取上清液III加入其體積2倍的無水乙醇，再加入其體積1/10的NaAc溶液，靜置 2小時以上，得沉淀；
[0029] 5)將步驟4)所得沉淀洗滌后烘干，烘干溫度為37°C，時間為8~IOmin ;
[0030] 6)將步驟5)烘干后的沉淀溶解后常溫靜置2小時，即得文冠果DNA樣