作為植物害蟲特別是鱗翅目和雙翅目的生物防治劑的側孢短芽孢桿菌的新菌株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及側孢短芽孢桿菌（Brevibacillius Iaterosporus)的新菌株，以及含 有該菌株的組合物，還提供了使用該新菌株及組合物生物防治昆蟲害蟲包括小菜蛾和蚊子 的方法。
【背景技術】
[0002] 昆蟲害蟲代表著現代農業顯著的經濟成本，目前的農業系統通常需要一種或幾種 作物或植物類型以進行大面積生長。這種不平衡的生態系統容易受到昆蟲的壓力。
[0003] -些昆蟲害蟲也會危害動物包括人類的健康，例如，已知蚊子會攜帶多種疾病。因 此，它們會作為疾病傳播的載體。
[0004] 傳統上，昆蟲害蟲的防治一直追求殺蟲劑（insecticide)和農藥（pesticide)的 使用。然而，消費者越來越關心化學殘留物以及它們對動物和植物健康以及環境的影響。此 外，很多昆蟲害蟲變得耐農藥和殺蟲劑。
[0005] 生物防治代表著一種防治昆蟲害蟲的替代方法，以減少對化學品的依賴。這種"天 然"方法比化學防治方法更容易被公眾接受，且更有效和更可持續。
[0006] 已經研宄了包括細菌、酵母和真菌的范圍廣泛的生物防治劑在防治昆蟲害蟲中的 應用。一種廣泛研宄的殺蟲用細菌種類是芽孢桿菌。
[0007] 芽孢桿菌是一個包括具有從對動物和植物健康有害到對昆蟲防治有好處而變化 的性質的許多不同細菌種類的屬。
[0008] 特別地，蘇云金芽孢桿菌（Bt基因）是一個眾所周知的生物防治劑，可商購的產 品如 Thuricide?和 Dipel?。
[0009] 近年來已經出現了昆蟲對Bt發展的抗性的證據，請參閱例如Tabashnik等 (1990) ;Baxter等（2011);和Tabashnik等（1998)。因此，仍然需要一種用于防治害蟲（包 括昆蟲害蟲）的新芽孢桿菌種類。
[0010] 本發明的申請人現在已經確定了一些作為生物防治劑有效的新側孢短芽孢桿菌。
[0011] 因此，本發明的一個目的是提供作為生物防治劑有用的側孢短芽孢桿菌新菌株， 另一個目的是提供含有至少一種本發明的新的側孢短芽孢桿菌菌株的組合物；和/或至少 為公眾提供一種有用的選擇。
【發明內容】
[0012] 一方面，本發明提供了一種對至少一個鱗翅目種類和至少一個雙翅目種類具有殺 蟲活性的分離的側孢短芽孢桿菌菌株。
[0013] 在一種實施方式中，至少一個鱗翅目種類是小菜蛾（diamondback moth，Plutella xylostella)〇
[0014] 在一種實施方式中，至少一個鱗翅目種類是甘藍尺蠖蛾（cabbage looper moth， Trichoplusia ni)〇
[0015] 在一種實施方式中，至少一個鱗翅目種類選自卷蛾科和菜蛾科。
[0016] 在另一種實施方式中，至少一個雙翅目種類是蚊種類。
[0017] 在另一種實施方式中，蚊種類選自庫蚊（Culex pervigilans)和棕色造物主 (Opifex fuscus) 〇
[0018] 在另一種實施方式中，側孢短芽孢桿菌菌株對小菜蛾（Plutella xylostella)和 選自庫蚊（Culex pervigilans)和棕色造物主（Opifex fuscus)的至少一種蚊種類都有活 性。
[0019] 在一種實施方式中，側孢短芽孢桿菌菌株是生物純培養物的形式。
[0020] 分離的側孢短芽孢桿菌菌株或生物純培養物可選自菌株NMI No. V12/001946,NMI N〇.V12/001945 和 NMI N〇.V12/001944。
[0021] 一方面，本發明提供了側孢短芽孢桿菌菌株NMI No. V12/001946的生物純培養物。
[0022] 另一方面，本發明提供了側孢短芽孢桿菌菌株匪I NO.V12/001945的生物純培養 物。
[0023] 另一方面，本發明提供了側孢短芽孢桿菌菌株匪I NO.V12/001944的生物純培養 物。
[0024] 另一方面，本發明提供了一種含有至少一種本發明的側孢短芽孢桿菌菌株以及農 業上可接受的載體的組合物。
[0025] 在一種實施方式中，本發明提供了含有一種或多種選自匪I No. V12/001946,匪I No. V12/001945和NMI No. V12/001944的側孢短芽孢桿菌菌株以及農業上可接受的載體的 組合物。
[0026] 在一種實施方式中，所述組合物可含有兩種本發明的側孢短芽孢桿菌菌株。在另 一種實施方式中，所述組合物可含有三種本發明的側孢短芽孢桿菌菌株。
[0027] 在一種實施方式中，所述組合物基本上由一種或多種選自匪I No. V12/001946、 NMI No. V12/001945和NMI No. V12/001944的側孢短芽孢桿菌菌株和農業上可接受的載體 組成。
[0028] 在一種實施方式中，所述組合物基本上由兩種本發明的側孢短芽孢桿菌菌株和農 業上可接受的載體組成。在另一種實施方式中，所述組合物基本上由三種本發明的側孢短 芽孢桿菌菌株組成。
[0029] 在一種實施方式中，所述組合物為殺蟲劑組合物。
[0030] 另一方面，本發明提供了一種用于防治至少一種害蟲的方法，該方法包括用本發 明的組合物接觸至少一種害蟲。
[0031] 另一方面，本發明提供了一種用于防治至少一種害蟲的方法，該方法包括用本發 明的一種或多種側孢短芽孢桿菌菌株接觸至少一種害蟲。
[0032] 優選地，所述至少一種害蟲為昆蟲害蟲，更特別地，所述至少一種害蟲選自鱗翅目 和雙翅目。
[0033] 所述菌株的應用，本發明方法中的本發明的菌株或組合物可防治一種以上類型的 害蟲。
[0034] 因此，在另一種實施方式中，所述至少一種害蟲為昆蟲害蟲，選自鱗翅目、雙翅目 中的一種或兩種。
[0035] 在一種實施方式中，所述至少一種昆蟲害蟲選自小菜蛾和蚊子。
[0036] 在另一種實施方式中，所述至少一種害蟲為選自小菜蛾、蚊子中的一種或兩種的 昆蟲害蟲。
[0037] 在一種實施方式中，鱗翅目選自卷蛾科（Tortricidae)、菜蛾科（Plutellidae)和 夜蛾科（Noctuidae)。在一種具體的實施方式中，鱗翅目選自卷蛾科和菜蛾科。
[0038] 在另一種實施方式中，所述至少一種昆蟲害蟲是蛾。在一種實施方式中，所述 蛾選自由小菜蛾（Plutella xylostella)、甘藍尺蠖蛾（Trichoplusia ni)、蘋果蠹蛾 (Cydia pomonella)、普通森林尺蠖蛾（Pseudocoremia suavis)、棉鈴蟲蛾（Helicoverpa armigera)、蘋果淺褐卷葉蛾（Epiphyas postvittana)、黑腿稻縱卷葉螟蛾（Planotortrix notophaea)和黑琴稻縱卷葉螟（black lyre leafroller，Cnephasia jactatana)組成的 組。
[0039] 在另一種實施方式中，所述害蟲為線蟲。在一種具體的實施方式中，所述線蟲為微 蟲（microworm)。優選地，所述微蟲為全齒復活線蟲（Panagrellus redivivus)。
[0040] 在另一種實施方式中，所述昆蟲害蟲為胡蜂（wasp)。在一種具體的實施方式中，所 述胡蜂為普通黃胡蜂（Vespula vulgaris)。
[0041] 在另一種實施方式中，所述昆蟲害蟲為麥盧卡甲蟲（Pyronta sp.)。
[0042] 定義
[0043] 本文所用的術語"殺蟲劑"是指作用為殺死或防治昆蟲生長的藥劑。
[0044] 本文所用的術語"接觸"是指以一種對有效的害蟲防治有用的方式將本發明的組 合物或菌株提供給害蟲。最普遍的接觸將會涉及將含有本發明的組合物或菌株的材料對害 蟲喂食，但不限于此。因此，接觸包括喂食。
[0045] 本文可互換使用的術語"防治（control) "，"防治中（controlling) "，"生物防治 (biocontrol) "或"生物的防治（biological control) "是指使用本發明的菌株或組合物 以實現害蟲特別是昆蟲害蟲的數量的減少。一般理解的是數量上的減少，或害蟲的消滅，或 它們繁殖率的抑制。
[0046] 本說明書中所用的術語"含有（comprising) "意思是"由至少部分組成 (consisting at least in part of)"，當解釋說明書中包括術語"含有（comprising)" 的 每個語句時，除了由該術語開頭的那些特征也可以存在。相關術語例如"含有（comprise)" 和"含有（comprises) "，以及術語"包括（including) "，"包括（include) "和"包括 (includes) "也以相同的方式解釋。
[0047] 當術語"基本上由……組成"用在本說明書中時，該術語是指確定的特征且允許不 實質上改變所指定的特征的基本特性的其它特征的存在。
[0048] 術語"農業上可接受的載體"涵蓋了本領域中所有已知的液體和固體載體，例如水 和油，以及佐劑、分散劑、粘合劑、濕潤劑（wettants)、表面活性劑、保濕劑、增粘劑等，它們 是已知常規的用于在防治組合物（包括殺蟲劑組合物）的制備中應用的。
[0049] 本文中所用的術語"有效量"的意思是對防治或消滅害蟲（特別是昆蟲害蟲）起 作用的用量。
[0050] 本文所用的術語"生物純培養物"或者"生物純分離物"是指含有至少90 %，優選 為95 %，優選為99 %，更優選為至少99. 5 %的側孢短芽孢桿菌菌株細胞的本發明的側孢短 芽孢桿菌菌株的培養物。
[0051] 本文所用的術語"害蟲"是指給人類帶來不便的有機體。在一種實施方式中，該術 語是指對動物（包括人類），或植物造成傷害的有機體。該傷害可涉及植物或動物健康、生 長、產量、繁殖或生存能力（viability)，且可以是表面的傷害（cosmetic damage)。優選地， 該傷害是商業上顯著的。在一種優選實施方式中，術語"害蟲"是指對植物造成傷害的有機 體。優選地，該植物為栽培植物。
【具體實施方式】
[0052] -方面，本發明涉及具有殺蟲（包括昆蟲害蟲以及特別是鱗翅目和雙翅目）活性 的側孢短芽孢桿菌菌株。
[0053] 側孢短芽孢桿菌是一種形成昆蟲病原細菌的需氧孢子，已知其對一些昆蟲種類是 致病的。像蘇云金芽孢桿菌，側孢短芽孢桿菌的特征在于孢子囊裂解后，在孢子的一側上產 生的典型的獨木舟狀類芽孢體（CSPB)的制劑。
[0054] 側孢短芽孢桿菌已被記錄為目標寄生線蟲（Bone and Singer, 1991 ;Huang et al·，2005 ;Singer, 1996)、軟體動物、鞘翅目（Boets et al·，2004 ;Schn印f et al·，2003; Singer, 1996;Singer et al.，1997)、雙翅目（Favret and Yousten，1985;Rivers et al.，1991)和鱗翅目黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis) (De Oliveira et al.，2004)的卵 和幼蟲的病原體。不同的毒力因子已被記錄在不同的側孢短芽孢桿菌菌株間（Favret and Yousten, 1985 ；Rivers et al. , 1991 ；Zahner et al.，1999)〇
[0055] Orlova等（1998)在對雙翅目種類（包括黃熱病蚊子Aedes aegypti)的幼蟲 的生物檢測中首次證明了側孢短芽孢桿菌的毒性活性與它的孢子和晶體的相關性。這 種蚊子可作為黃熱病和其它疾病如登革熱和切昆貢亞熱（Chikungunya)的載體。對黑 幡（Simulium vittatum)、蚊子（Culex quinquefasciatus 和 Aedes aegypti) (Favret 和 Yousten, 1985 ;Rivers et al·，1991)，和家幡（Musca domestica(Ruiu et al. 2006))， EP2, 079, 314的幼蟲的活性也已有報道。
[0056] 側孢短芽孢桿菌對鞘翅目種類的活性首次在初步生物檢測中進行了報 道，該種類包括煙草甲蟲Lasioderma serricorne和科羅拉多甲蟲Leptinotarsa decemlineata(Rivers et al.，1991)。不同側抱短芽抱桿菌菌株對玉米根蟲（Diabratica spp.)的活性已有報道（Aronson et al.，1991 ;Schnepf et al.，2002 ;Boets et al.，2011)。玉米根蟲是玉米作物的主要的農業害蟲。
[0057] De Oliveira等（2004)報道了對墨西哥棉鈴象甲Anthonomus grandis (與糧食傷 害相關的害蟲）的高毒性，在相同的研宄中也報道了對黎豆毛蟲Anticarsia gemmatalis 的鱗翅類的活性。
[0058] 然而，迄今為止沒有任何報道來討論菌株對雙翅目和鱗翅目的活性。Rivers等 (1991)篩選了 28株針對毛蟲、蚊子和鞘翅目（馬鈴薯甲蟲）的菌株，發現對毛蟲沒有活性， 但對其它兩個組有活性。Favret和Yousten (1985)也發現對蚊子有活性，但是對鞘翅目沒 有活性。
[0059] 令人驚訝的是，申請人現在已經確定了對一系列昆蟲害蟲（包括一些鱗翅目和雙 翅目）具有活性的側孢短芽孢桿菌菌株。特別地，已從甘藍種子和新西蘭土壤中分離出 來了三種細菌，側孢短芽孢桿菌的菌株。篩選檢測顯示這三種菌株對小菜蛾幼蟲，小菜蛾 Plutella xy