用于分子分析的胚取樣的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求提交于2013年3月15日的美國臨時申請61/786968和提交于2012 年11月5日的美國臨時申請61/722399的權益，它們全部內容以引用方式并入本文。
技術領域
[0003] 本公開涉及用于取樣分離的胚以鑒定能夠發育成具有所需特性的植株的胚的方 法。
【背景技術】
[0004] 在傳統的植物育種中，種植基于已知的雜交或自花授粉的植物世代并且隨后進行 測試，從而得知品系或品種是否趨于具有市場上期望的特性。這是本領域可認識到并且熟 知的，這些實驗可為大規模的。它們涉及從科學家到現場工作人員范圍內的大量勞動力以 設計、種植、維護、以及進行實驗，可能涉及幾千或幾萬株單個植株。它們也需要可觀的土地 資源。實驗田或溫室可能占據幾千英畝土地。當植株萌發、生長、以及產生種子期間（在此 期間可對它們采樣用于實驗室或田間測試），這不但占據大量土地數月之久，而且之后的大 量種子必須進行單獨標記、收獲和處理。
[0005] 一個另外的問題是很多實驗是無效結果。文獻已經報道一些種子公司在實驗中棄 去早期任何世代的80-90%的植株。因此，對于大部分種子，供其生長、收獲、及收獲后處理 所消耗的大量土地、勞動力和材料資源最終被浪費了。
[0006] 時間壓力也是一個因素。植物育種方面的顯著進步已經施加更多的壓力于育種程 序，以較快速地推進植物品系或品種獲得更多更好的性狀和特性。植物育種者和相關聯的 工人因此受到增大的壓力以更高效地和更有效地處理這些世代，以及更多更早地選擇應繼 續進行下一代育種的植株。
[0007]多個當前使用的方案已經加速了植物育種產生的收獲，并且具有相當大的成本節 約。例如，用于產生加倍單倍體的方案已經不需要多年的自交以及后續的評估來獲得純合 植株。此外，遺傳標記數據的應用以及獲取它們的便利性已經允許在消耗大量資源之前從 種群中去除不包含期望特性的植株。此外，近來的案例已經利用在種子階段基于實驗室 的測試，通常稱為"籽粒切片"或"種子切片"，其中種子進行非破壞性測試以獲取遺傳、生 物化學或表型信息（Sangtong，V?等人（2001) Plant Molecular Biology Reporter 19 : 151-158)。測試種子不需要使種子生長成幼苗，從而節省了時間、空間、和工作量。
[0008] 然而，仍可進行進一步改善。具體地，需要甚至在發育更早期分子表征胚的方法， 尤其是作為加倍單倍體方法或利用胚挽救技術的其它方法的一部分。
【發明內容】
[0009] 本公開涉及通過使用胚取樣促進植物改善活動的方法。通過本文所述方法，測試 各個分離的胚并僅選擇能夠發育成具有一個或多個期望特性的植株的那些胚是可能的。這 允許用于植物改善和管理的新的和更有效的方法，產生改善的育種群體。
[0010] 本文提供了分析單子葉植物的分離的胚的方法。在此類方法中，從分離的胚切除 一片盾片組織，其中所述切除不引起胚發芽可能性的顯著降低。隨后分析該片盾片組織是 否存在指示至少一個遺傳性狀的一個或多個特性。
[0011] 分離的胚可為未成熟的，并且它可來自玉米、高粱、小麥、稻、大麥、燕麥、裸麥、粟、 甘蔗、黑小麥、或柳枝稷。分離的胚可直接獲取自種子，或者它可來源于其它組織。分離的 胚可為新鮮的或冷卻的。分離的胚是活的并且能夠在切除所述盾片組織片后發芽長成植 株。分離的胚可為任意倍數性的，諸如但不限于單倍體、二倍體、加倍單倍體、非整倍體、四 倍體、六倍體、或八倍體。
[0012] 從分離的胚切除的該片盾片組織在取樣后可為凍干的、新鮮的、冷凍的、或冷卻 的。
[0013] 該片盾片組織的尺寸可等于或大于單個細胞核。
[0014] 盾片組織的切除可通過本領域已知的任何裝置進行，諸如但不限于：鉆頭、噴水 器、激光、單刀片、一組相對刀片、注射器、芯取樣器（取芯工具）、外科手術刀、小直徑的線、 小直徑的變形鋼絲繩、刮刀、和拭子。切除可手動進行或通過自動化方法進行。
[0015] 分離的胚可定位為分生組織向下，其中從分生組織的相對端切片。定位可手動進 行或利用機械運動、致動等以自動化方式進行。自動化可包括使用機器人、視覺系統、或二 者的組合。
[0016] 可分析盾片組織的片的一個或多個特性，所述特性選自：遺傳標記、單核苷酸多態 性、簡單重復序列、限制性片段長度多態性、單倍型、標簽SNP、遺傳標記的等位基因、基因、 DNA來源的序列、RNA來源的序列、啟動子、基因的5'非翻譯區、基因的3'非翻譯區、微 RNA、siRNA、QTL、衛星標記、轉基因、mRNA、dsmRNA、轉錄模式、甲基化模式、和倍數性水平。
[0017] 本文提供了分析雙子葉植物的分離的胚的方法。在此類方法中，從分離的胚切除 一片子葉組織，其中所述切除不引起胚發芽可能性的顯著降低。隨后分析該片子葉組織是 否存在指示至少一個遺傳性狀的一個或多個特性。
[0018] 分離的胚可為未成熟的，并且其可為卡諾拉、大豆、向日葵、苜蓿、或棉花。分離的 胚可直接獲取自種子，或者它可來源于其它組織。分離的胚可為新鮮的或冷卻的。分離的 胚是活的并且能夠在切除所述子葉組織片后發芽長成植株。分離的胚可為任意倍數性的， 諸如但不限于單倍體、二倍體、加倍單倍體、非整倍體、四倍體、六倍體、或八倍體。
[0019] 從分離的胚中切除的該片子葉組織在取樣后可為凍干的、新鮮的、冷凍的、或冷卻 的。
[0020] 該片子葉組織的尺寸可等于或大于單個細胞核。
[0021] 子葉組織的切除可通過本領域已知的任何裝置進行，諸如但不限于：鉆頭、噴水 器、激光、單刀片、一組相對刀片、注射器、芯取樣器（取芯工具）、外科手術刀、小直徑的線、 小直徑的變形鋼絲繩、刮刀、和拭子。切除可手動進行或通過自動化方法進行。
[0022] 可分析子葉組織的片的一個或多個特性，所述特性選自：遺傳標記、單核苷酸多態 性、簡單重復序列、限制性片段長度多態性、單倍型、標簽SNP、遺傳標記的等位基因、基因、 DNA來源的序列、RNA來源的序列、啟動子、基因的5'非翻譯區、基因的3'非翻譯區、微 RNA、siRNA、QTL、衛星標記、轉基因、mRNA、dsmRNA、轉錄模式、甲基化模式、和倍數性水平。
【具體實施方式】
[0023] 本文中所列出的每個參考集的公開內容均據此全文以引用方式并入本文。
[0024] 除非上下文另外明確規定，否則如本文和所附權利要求書中所用的單數形式"一 個"、"一種"以及"所述"包括復數涵義。因此，例如，"一株植物（a plant)"的涵義包括多 株此類植物，"一個細胞（a cell)"的涵義包括一個或多個細胞以及它們為本領域技術人員 所知的等同物，諸如此類。
[0025]如本f所用:
[0026] "愈傷組織"是指去分化的增殖細胞塊或組織塊。
[0027]短語"接觸"、"與...接觸"或"與...接觸放置"可用于指代"直接接觸"或"間 接接觸"。例如，包含加倍劑的培養基可直接接觸單倍體細胞或者包含加倍劑的培養基可通 過濾紙、植物組織、或其它細胞與單倍體細胞分開，從而加倍劑通過濾紙或細胞轉移到單倍 體細胞中。
[0028] "二倍體"植物具有兩組（基因組）染色體并且染色體數（2n)等于合子的染色體 數。
[0029] "加倍單倍體"或加倍單倍體植物或細胞通過加倍染色體單倍體組發育。獲取自自 交任意數目世代的加倍單倍體植物的植物或種子仍可認為是加倍單倍體植物。認為加倍單 倍體植物是純合植物。如果一株植物是能繁殖的，將認為它是加倍單倍體，即使植物的整個 營養部分不包括具有加倍染色體組的細胞。例如，如果一株植物包含活的配子，將認為它是 加倍單倍體植物，即使它是嵌合的。
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