一種建立乙醇、hbv雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的方法
【專利說明】一種建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的 方法 發明領域
[0001] 本發明涉及動物模型領域，具體的說，是一種建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前 病變小鼠模型的方法。
【背景技術】
[0002] 肝癌即肝臟惡性腫瘤，可分為原發性和繼發性兩大類。原發性肝臟惡性腫瘤起源 于肝臟的上皮或間葉組織，前者稱為原發性肝癌，是我國高發的，危害極大的惡性腫瘤；后 者稱為肉瘤，與原發性肝癌相比較較為少見。繼發性或稱轉移性肝癌系指全身多個器官起 源的惡性腫瘤侵犯至肝臟。一般多見于胃、膽道、胰腺、結直腸、卵巢、子宮、肺、乳腺等器官 惡性腫瘤的肝轉移。
[0003] 全球大約有3. 5億人是乙肝病毒（HBV)的慢性攜帶者，中國更是HBV感染高發區， 約7億人感染過HBV，流行病學研宄已經證實HBV感染與肝細胞癌（HCC)的發展之間存在著 密切相關性。國際衛生組織（WHO)指出："酒精毒性對肝臟的影響最大，對病毒性肝炎、肝癌 等的發生、發展及預后都有重要影響"。如果酗酒的同時又并發肝炎病毒感染，其肝癌發生 率可高達50%以上。我們應該認識到至少25%的乙醇性肝病患者同時并發HBV感染及演 變為肝癌的高危性。因此，針對HBV感染同時飲酒的肝癌高危人群，建立的乙醇性HBV轉 基因小鼠肝癌癌前病變模型，為肝癌癌前病變動物模型的建立探索新的方法，為深入研宄 肝癌發生發展的分子生物學機制奠定基礎。
[0004] 目前應用最廣泛的主要都是采用誘發性肝癌癌前病變模型，其中最常用的大多數 都是化學、生物致癌因素作用于實驗動物如：2_乙酰氨基芴（2-AAF);二乙基亞硝胺（DEN); 黃曲霉毒素Bl(AFBl);二甲基氨基偶氮苯（DAB);四氯化碳（CCL4)等。但是還沒有一種公 認的針對酗酒的同時并發肝炎病毒感染誘發的肝癌模型用于實驗研宄，如何選擇和研宄更 為理想的肝癌癌前病變模型則是關鍵所在。
【發明內容】
[0005] 本發明的目是提供一種建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：
[0007] -種建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)動物：1. 3拷貝高復制HBV轉基因小鼠；
[0009] 2)試劑：白酒；
[0010] 3)肝癌癌前病變小鼠模型的制備：HBV轉基因小鼠每天給予白酒，連續灌胃16-30 周，期間小鼠自由進食、飲水；
[0011] 4)肝癌癌前病變模型小鼠后期處理：灌胃結束后，分別稱重，取小鼠處死，取肝組 織，稱肝重，計算肝臟指數，并進行病理切片觀察。
[0012] 所述步驟1)中，1.3拷貝高復制HBV轉基因小鼠為6-8周齡，體重23±2g，雄性。
[0013] 所述步驟3)中，HBV轉基因小鼠灌胃白酒前，先適應性飼養一周以上。
[0014] 所述步驟3)中，白酒酒精度為53%vol，劑量為10ml?kg'次數為每天一次。
[0015] 所述步驟3)中，小鼠在灌胃白酒的過程中，需5天稱一次體重，并根據體重變化調 整灌胃劑量。
[0016] 所述步驟3)中，小鼠灌胃白酒的時間為22周。
[0017] 所述步驟4)中的具體操作方法為：灌胃結束后，分別稱重，將小鼠摘除眼球取血， 頸椎脫臼處死小鼠，處死后的小鼠立即取出肝臟，鹽水沖洗后，吸干水分稱重，計算小鼠肝 臟指數，然后放入已準備好的4%多聚甲醛固定液瓶中固定、脫水、包埋、切片、HE染色，在 400倍光鏡下觀察肝組織病理情況。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0019] 1、本發明動物模型制作簡單，費用低，易重復；
[0020] 2、本發明22周乙醇誘導的HBV轉基因型小鼠模型組可于鏡下見到肝細胞不典型 增生有大細胞性和小細胞性改變，符合肝癌癌前病變模型判斷標準，顯示推斷造模成功。
【附圖說明】
[0021] 圖1肝組織病理切片HE染色結果X400, 22周酒精模型組。
[0022] 圖2肝組織病理切片HE染色結果X400, 22周空白對照組。
[0023] 圖3肝組織病理切片HE染色結果X400,16周酒精模型組。
[0024] 圖4肝組織病理切片HE染色結果X400,16周空白對照組。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖1-4對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0026] 實施例
[0027] 1 ?材料
[0028] 1. 1動物1. 3拷貝高復制HBV轉基因小鼠，雄性，6-8周齡，體重23±2g，32只，購 自中國人民解放軍第四五八醫院全軍肝病中心，動物合格證號：SCXK(軍）2012-0018。
[0029] 1. 2試劑酒精度為53%vol紅星二鍋頭白酒，產自（北京紅星股份有限公司），產 品標準號：GB/T10781. 2 ;4%多聚甲醛（Biotoopped公司）。
[0030] 1. 3儀器TB-21?型電子天平（美國丹佛公司）；YB-6LF型生物組織石蠟包埋機 (湖南亞光公司）；冊2235型組織切片機（德國LEICA公司）；YT-7F型攤烤片機（湖南亞 光公司）；BX51型顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。
[0031] 2?方法
[0032] 2. 1肝癌癌前病變小鼠模型的制備32只HBV轉基因小鼠適應性飼養一周后，隨機 分為16周對照組，16周模型組，22周對照組和22周模型組，每組8只。模型組給予酒精度 53%vol紅星二鍋頭白酒劑量為10ml 灌胃，每天一次，對照組小鼠給予等體積蒸餾水 灌胃，每天一次。小鼠自由進食、飲水，每5天稱一次體重，根據體重變化調整灌胃劑量，小 鼠分別于第16、22周末取相應組小鼠處死，取肝組織行病理切片，觀察肝臟病理變化。
[0033] 2. 2小鼠一般情況觀察實驗過程中觀察小鼠的活動情況、精神狀態、皮毛光澤度、 食欲等。
[0034] 2. 3小鼠肝重和肝臟指數的影響于造模第16、22周末各組分別稱重后，摘除眼球 取血，頸椎脫白處死小鼠，處死后立即取小鼠肝臟，鹽水沖洗后，吸干水分稱重，計算小鼠肝 臟指數，肝臟指數=肝臟重量/小鼠體重（g)X100。
[0035] 2. 4肝組織形態學影響于造模第16、22周末取相應小鼠的肝組織，鹽水沖洗吸干 水分后放入已準備好的4%多聚甲醛固定液瓶中固定、脫水、包埋、切片、HE染色，在400倍 光鏡下觀察肝組織病理情況。
[0036] 2. 5評價標準根據文獻制定：①顯微鏡下可見肝細胞不典型增生（小細胞性改變 和/或大細胞性改變）；②肉眼可見肝組織出現結節性或局灶性改變。出現①和/或②即 可判定為肝癌癌前病變。
[0037] 2. 6統計學分析采用SPSS18. 0軟件包統計分析，數據以F±s表示，組間比較采用 t檢驗。P〈0. 05作為差異具有統計學意義的標準。
[0038] 3?結果
[0039] 3. 1小鼠一般狀況對照組小鼠灌胃后，精神、呼吸、運動均正常，毛發光澤，對刺激 反應靈敏，進食飲水正常并隨體重增加略有增加。模型組小鼠灌胃初期小鼠灌胃后出現精 神萎靡、呼吸急促、活動減少、對刺激反應減弱、嗜睡、進食飲水減少等情況，從實驗開始第4 周起，模型組小鼠灌胃后精神萎靡、呼吸急促、嗜睡現象開