一種選育甘藍型黃籽油菜隱性核不育臨保系的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農作物育種技術領域，尤其涉及一種選育甘藍型黃籽油菜隱性核不育臨保系的方法。
【背景技術】
[0002]甘藍型黃籽油菜種皮較薄、種子含油量高、油清澈透明、餅柏蛋白質含量高、纖維素和多酚含量低、飼料利用價值高，極大地改善了菜籽油和餅柏的商品價值，培育甘藍型黃籽油菜已成為油菜育種的重要目標之一。瑞典教授Olsson(1960)從人工合成的甘藍型油菜中首次找到了黃籽資源。此后，西德Robbelen(1981)、Jonsson(1983)、加拿大Stefansson (1986)也發現了甘藍型黃籽油菜資源。1975年，華中農大劉后利教授從甘藍型種間雜種后代中首次在中國發現了甘藍型黃籽油菜。此后，國內其它單位如陜西省農墾中心(1980)、貴州農學院(1982)、江蘇省農科院(1984)、中國農科院油料所(1985)等都對甘藍型黃籽油菜開展了大量的應用和基礎研宄工作。
[0003]與傳統育種比較，小孢子培養技術可以縮短育種年限，提高育種效率。過去采用雜交育種法育成一個遺傳性穩定的品種，需要很多年的時間。育種專家必須通過廣泛的雜交、回交，然后進行自交，以保證新品種的同質性。現用小孢子培養方法，可以利用匕代產生的小孢子進行培養，獲得單倍體植株，再經秋水仙堿使染色體加倍獲得DH，育種時間可以縮短幾年，特別適用于難以穩定性狀的純合，如甘藍型油菜黃籽性狀的純合。同時育種家利用DH系在一個較小的群體中進行選擇，可以大大提高常規育種的效率。例如在油菜低芥酸育種中，由于低芥酸油菜含雙隱性基因，它在雙單倍體中出現的頻率是1/4，而在通常F2代中出現的頻率是1/16。
[0004]黑籽隱性全不育系WSL1A是西南大學2013年選育定型的不育系，并于2013年4月通過重慶市品種審定委員會的鑒定。該品系的選育過程是從2006年引進皖油23雜種和德國NPZ公司MSL不育系材料開始，2007年對皖油23后代分離出的不育株與可育株成對兄妹交，皖油23后代和NPZ公司MSL不育系相互雜交，2008年根據育性分離和恢保關系鑒別隱性純合兩用系SL1AXSL1BdOOg年互換可育株測交確定臨時保持系WSQB。2010-2012年連續臨時保持系WSL1B與隱性純合兩用系不育株SL1A雜交，驗證雜交后代為全不育系，進而定型為WSLA。該不育系花朵呈鮮黃色，花瓣小、雌蕊正常、雄蕊退化為褐色枯死狀。甘藍型黃籽恢復系SWU-05R來源于甘藍型油菜多品系復合雜交后代經測交和定向選育獲得的雙低品系，SWU-05R于2013年4月通過重慶市品種審定委員會的鑒定。利用隱性全不育和恢復系可以生產雜交種，該不育系統選育的雜交種“渝油27”于2012年通過重慶市審定，已在生產上大面積推廣。
[0005]選育甘藍型黃籽油菜隱性全不育系是黃籽油菜雜交授粉系統的一個重要途徑，獲得黃籽臨保系是先決條件。但是由于目前的臨保系WSL1B為黑籽，臨保系受2對以上隱性基因控制，需要廣泛大量的測交。常規育種方法選育出的甘藍型黃籽油菜都為WSL1A的恢復系，通過常規育種方法轉育黃籽臨保系，分離群體大，測交工作量和測交種后代育性鑒定工作量大，田間實施難度大。
【發明內容】
[0006]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種選育甘藍型黃籽油菜隱性核不育臨保系的方法，本發明提供的方法能夠快速獲得性狀純合、遺傳穩定的黃籽隱性核不育臨保系，方法簡單，原始材料容易獲得。
[0007]本發明提供了一種選育甘藍型黃籽油菜隱性核不育臨保系的方法，包括:
[0008]a)以黑籽隱性全不育品系為母本，甘藍型黃籽品系為父本進行雜交，獲得匕代；
[0009]b)采用甘藍型油菜小孢子培養技術對Fl代植株的游離小孢子誘導培養，獲得DH株系；
[0010]c)將DH株系與隱性純合兩型品系中的不育株測交，得到甘藍型黃籽油菜核不育臨保系。
[0011]本發明首先以黑籽隱性全不育為母本，以甘藍型黃籽品系為父本雜交，獲得匕代；然后采用甘藍型油菜小孢子培養技術對F1代植株的游離小孢子誘導培養，秋水仙堿加倍獲得DH株系；選擇黃籽DH株系并與隱性純合兩型系不育株測交，測交種為100%不育，對應的黃籽DH單株即為本發明所述的黃籽隱性核不育臨保系。通過本發明可以快速獲得遺傳穩定、性狀純合的黃籽臨保系，為甘藍型黃籽油菜雜交育種親本創制提供新途徑。
[0012]在本發明中，所述黑籽隱性全不育品系為WSL1A，系西南大學王瑞副研宄員選育而成，并于2013年4月通過重慶市品種委員會的鑒定。該不育系含油量40.09%、芥酸為0.02%、硫苷29.8umol/g，抗倒性強，農藝性狀較為優良。
[0013]所述甘藍型黃籽品系為甘藍型黃籽恢復系SWU-05R，系西南大學李加納教授選育而成，于2013年4月通過重慶市品種審定委員會的鑒定。該黃籽品系含油量41.44%、芥酸0%、硫苷含量26.3umol/g，農藝性狀優良。
[0014]按照本領域技術人員公知的方法，在油菜花期以WSL1A為母本，以SWU-05R為父本雜交，獲得匕代種子。
[0015]接著，采用甘藍型油菜小孢子培養技術對Fl代植株的游離小孢子誘導培養，獲得DH株系；具體方法如下:
[0016]bl)以F1代植株為供體，花期從油菜花序上取花蕾，在小孢子分離培養基中研磨、過濾、離心后獲得小孢子沉淀物；
[0017]b2)將步驟bl)獲得的小孢子沉淀物在含秋水仙堿的胚狀體誘導培養液中培養；然后將獲得的培養物離心，離心得到的小孢子沉淀物在不含秋水仙堿的胚狀體培養液中培養至可見胚狀體，轉到搖床上繼續培養至子葉期；
[0018]b3)將步驟b2)獲得的子葉期胚狀體轉入胚狀體成苗培養基中繼續培養至成苗；
[0019]b4)步驟b3)獲得的苗繼續生長至花期，獲得DH株系。
[0020]將匕代種子種植得到F 植株后，花蕾期時從生長健壯的植株F ，摘取主花序或一次分枝花序頂端部分的花蕾，其長度優選為3.5?4.0mm。
[0021]在小孢子分離培養基中研磨之前，首先對花蕾進行消毒和無菌水清洗，具體操作如下:
[0022]將花蕾用75 %的酒精浸泡0.5-lmin，無菌水沖洗3次；再用0.1 %的HgCl2浸泡12min，無菌水沖洗3次，每次大約5min。
[0023]將花蕾在小孢子分離培養基中進行研磨，具體操作為:
[0024]將消毒后的花蕾轉入無菌小燒杯中，加入小飽子分離培養基，用玻璃注射器內筒擠壓花蕾。
[0025]將研磨后的花蕾經過過濾，將濾液進行離心，獲得小孢子沉淀物。在本發明中，優選經300目的濾網過濾。所述離心具體為:將濾液轉入帶刻度的容積為1ml的離心管中，100rpm離心3min，離心后倒掉上清液，重新加入小孢子分離培養基，離心3次，獲得小孢子沉淀物。
[0026]在本發明中，所述小孢子分尚培養基包括:B5大量兀素、B5微量兀素、B5有機添加物、FeNaEDTA 13.2mg.L—1 和蔗糖 130g.L ―1 (pH = 6.0)。具體而言，其包括:
[0027]2500mg/L 的 KN03、250mg/L 的 MgSO4.7H20、150mg/L 的 CaCl2.2H20、134mg/L 的(NH4)2SO4'150mg/L 的 NaH2PO4.Η20、0.83mg/L 的 ΚΙ、3.0mg/L 的 H3B03、10mg/L 的 MnSO4.4Η20、2.0mg/L 的 ZnSO4.7Η20、0.25mg/L 的 Na2MoO4.2Η20、0.025mg/L 的 CoCl2.6Η20、0.025mg/L的CuSO4.5H20、100mg/L的肌醇、1.0mg/L的煙酸、1.0mg/L的鹽酸卩比卩多醇、10mg/L的鹽酸硫銨、13.2mg/L的FeNaEDTA和130g/L的蔗糖；所述小孢子分離培養基的pH值為6.0。
[0028]獲得小孢子沉淀物后，將其加入含秋水仙堿的胚狀體誘導培養液中培養，所述含秋水仙堿的胚狀體誘導液包括:125mg/L的KN03、125mg/L的MgSO4.7H20、500mg/L的Ca4NO3.4H20、125mg/L 的 ΚΗ2Ρ04、26.4mg/L 的 FeNaEDTA、22.3mg/L 的 MnSO4.4Η20、6.2mg/L 的H3BO3> 8.6mg/L 的 ZnSO4.7Η20、0.025mg/L 的 CuSO4.5Η20、0.25mg/L 的 Na2MoO4.2Η20、0.025mg/L的CoCI2.6H20、100mg/L的肌醇、5mg/L的煙酸、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、0.5mg/L的鹽酸硫胺素、2mg/L的甘氨酸、0.5mg/L的葉酸、0.05mg/L的生物素30mg/L的谷胱甘肽、800mg/L的L-谷酰