一種橡膠樹體細胞胚胎發生和植株再生的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物細胞工程技術領域，具體涉及一種橡膠樹體細胞胚胎發生和植株 再生的方法。本發明以橡膠樹古銅期或淡綠期的芽條或芽條被摘頂后由其側芽萌發3-4周 的幼嫩側枝的帶腋芽的莖段為外植體，通過體細胞發生途徑獲得橡膠樹再生植株。
【背景技術】
[0002] 橡膠樹（HeveabrasiliensisMuell-Arg)屬大戟科橡膠屬，是多年生的異花授粉 喬木，在熱帶地區廣泛種植。其所產的天然橡膠是重要的工業原料和戰略物資，在國民經濟 中占有舉足輕重的地位。
[0003] 通過體細胞發生途徑來獲得再生植株是植物組培苗工廠化生產和遺傳轉化的重 要方法。現有技術中，橡膠樹體細胞發生途徑獲得再生植株主要采用花藥培養和內珠被培 養。
[0004] 橡膠樹花藥培養技術是以處于單核期的橡膠樹雄花為外植體，剝離雄蕊，接種于 誘導愈傷培養基中誘導愈傷組織，再將愈傷組織接種于誘導體胚培養基誘導體胚發生，最 后將成熟胚狀體接種于植株再生培養基中誘導出完整小植株。
[0005] 橡膠樹內珠被培養技術是以橡膠樹授粉后45-75天的幼果中的內珠被為外植體， 誘導愈傷組織，再經愈傷組織分化體胚，最后由成熟的胚狀體分化成植株。
[0006] 上述兩種再生技術體系均存在如下缺點：①易受取材季節制約，不能長期進行培 養。橡膠樹每年開花三次，分為春花、夏花和秋花，每次花期較短，一般為半個月，能進行花 藥培養的時間較短。眾所周知，橡膠樹的春花的自然授粉較高，而夏花、秋花的自然授粉較 低，因此內珠被的取材時間一般為春花自然授粉后45-75d，也就是在中國海南每年的5月 中旬至6月中旬為采樣進行內珠被培養的最佳時期，這種較短的取材時間嚴重制約了內珠 被的培養。②橡膠樹的植株再生極度依賴于基因型。在花藥培養中，僅限于海墾2、熱研 88-13等少數幾個品種成功建立花藥培養體系。在內珠被培養中，也僅限于PB260等少數 幾個品種成功建立內珠被培養體系。而對于大量的其它品種由于體胚發生能力差而不能 成功建立體細胞發生體系（孫愛花等，橡膠樹花藥的培養，植物生理學通訊，2006,42(4): 785-789;黃天帶等，橡膠樹內珠被研宄進展，生命科學研宄，2011，15 (2) :176-183)。這些 缺點制約了橡膠樹組培苗工廠化生產和遺傳轉化體系的建立，因此必須在橡膠樹中建立一 種高效、不受采樣時間限制和非基因依賴性的體細胞胚胎發生技術體系，為組培苗工廠化 生產和遺傳轉化體系的建立提供新技術途徑。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種橡膠樹體細胞胚胎發生和植株 再生的方法。本發明利用橡膠樹的芽條及其側芽生長不受季節影響的優勢，以幼嫩芽條和 芽條的幼嫩側枝中的腋芽為外植體，通過愈傷組織誘導、體胚發生和植株再生途徑，本發明 的方法不受采樣時間限制和非基因依賴性，是一種高效的橡膠樹體細胞發生培養體系。
[0008] 本發明通過下屬技術方案實現：
[0009] -種橡膠樹體細胞胚胎發生和植株再生的方法，其最佳實施方案包括下列步驟：
[0010] (1)外植體的選取、消毒和剝離：選取橡膠樹古銅期或淡綠期的芽條或芽條被摘 頂后由其側芽萌發3-4周齡的幼嫩側枝，用剪刀剪除葉片，將枝條切成1-1. 5cm帶有腋芽的 莖段。將帶有腋芽的莖段用洗潔精清洗5分鐘，再用自來水沖洗30分鐘，濾紙吸干，然后用 70%的酒精消毒30-60秒，0. 15%升汞溶液消毒8-12分鐘，用無菌水沖洗5遍，用無菌濾紙 吸干。將消毒好的莖段于無菌條件下置于超凈工作臺的體視顯微鏡中，小心剝離出橡膠樹 腋芽點外植體。
[0011] (2)愈傷組織誘導：將剝離出的橡膠樹腋芽點接種于愈傷組織誘導培養基中，于 24-28 °C暗培養50-70天。愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，附加2, 4-D(2， 4_二氯苯氧乙酸）10mg/L，NAA(萘乙酸）2mg/L，6-BA(6-芐基氨基嘌呤）0? 5mg/L，蔗糖 4〇g/L，椰子水5%(V/V)，Phytagel2. 2g/L;補充蒸餾水至1L。滅菌前調培養基的pH至 5. 8-6. 2〇
[0012] (3)體胚（胚狀體）誘導：將愈傷組織接種于胚狀體誘導培養基中于24-28°C暗培 養50-70天。胚狀體誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，將MS培養基中大量元素的 濃度降為80%，微量元素濃度增加1倍，附加6-BA0. 5mg/L，KT(細胞激動素）2mg/L，NAA lmg/L，GA3赤霉素）0? 5mg/L，活性碳 0? 1 % (W/V)，鹿糖 40g/L，Phytagel2. 2g/L;補充蒸餾 水至1L。滅菌前調培養基的pH至5. 8-6. 2。
[0013] (4)植株誘導：將成熟的胚狀體接種于植株誘導培養基中，于24_28°C，光照強度 為2000Lux條件下培養40-50天。植株誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，將MS培 養基中大量元素的濃度降為80%，附加KTlmg/L，GA3lmg/L，活性碳0. 1% (W/V)，蔗糖30g/ L，Phytagel2. 2g/L;補充蒸餾水至1L。滅菌前調培養基的pH至5. 8-6. 2。
[0014]申請人公開了一種適用于橡膠樹芽條或芽條摘頂后萌發的帶腋芽莖段的體細胞 胚胎發生和植株再生的培養基，按下述成分和配制方法配制：
[0015] (1)愈傷組織誘導培養基：以MS培養基為基礎培養基，附加2, 4-D10mg/L，萘乙 酸 2mg/L，6-芐基氨基嘌呤 0? 5mg/L，蔗糖 40g/L，椰子水 5 % (V/V)，Phytagel2. 2g/L; pH5. 8~6. 2 ；
[0016] (2)胚狀體誘導培養基：以MS培養基為基礎培養基，將MS培養基中大量元素的 濃度降為80 %，微量元素濃度增加1倍，附加6-芐基氨基嘌呤0. 5mg/L，細胞激動素2mg/ L，萘乙酸lmg/L,赤霉素 0.5mg/L，活性碳 0.1% (W/V)，鹿糖 40g/L，Phytagel2.2g/L; pH5. 8~6. 2 ；
[0017] (3)植株誘導培養基：以MS培養基為基礎培養基，將MS培養基中大量元素的 濃度降為80%，附加細胞激動素lmg/L，赤霉素lmg/L，活性碳0. 1 % (W/V)，蔗糖30g/L， Phytagel2. 2g/L;pH5. 8-6. 2。
[0018] 本發明建立的一種橡膠樹體細胞胚胎發生和植株再生的方法及其培養基可以在 橡膠樹離體繁殖中應用。
[0019] 本發明的有益效果：
[0020] 1.本發明所采用的外植體來源不受采樣季節限制，可以長年進行橡膠樹組織和細 胞培養的橡膠樹的芽條及其側芽，克服了現有技術的外植體取材時間上的制約。
[0021] 2.與現有技術相比，本發明克服了橡膠樹的基因型的制約，建立了橡膠樹非基因 型依賴的體細胞高效再生培養體系。
[0022] 3.本發明為橡膠樹芽條或芽條摘頂后萌發的帶腋芽莖段的組織培養快速成苗提 供了高效工廠化育苗技術，對我國橡膠樹戰略發展具有重要意義