一種高粱花藥高效誘導培養基配方的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高粱花藥高效誘導培養基配方，具體涉及一種顯著提高高粱花藥 出愈率的誘導培養基配方，屬于農業科學技術領域。
【背景技術】
[0002] 高梁為禾本科高粱屬一年生草本植物，是我國最早種植的禾谷類作物之一。高粱 在世界谷物生產中占有重要地位，6大洲47個國家每年種植面積約0. 45億hm，為世界第五 大作物。高梁具有食用、飼用、釀造用、能源用及加工用等多種用途，在我國，高梁主要用于 釀酒，但隨著畜牧業、能源業、加工業及膳食結構的改變，飼料、飼草高梁、能源甜高梁、帚用 高粱及食用高梁等具有特殊用途的高粱越來越受到重視，種植面積不斷擴大。
[0003] 高粱抗逆性強、適應性廣且綜合利用價值高而在國民經濟中占有不可替代的重要 地位。高粱具有耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿等多重抗性，生物量大，是公認的抗旱性較強的 作物，在水資源嚴重短缺的干旱和半干旱地區具有很大的發展潛力。高粱以其獨具的高含 糖量、高生物產量、高乙醇轉化率和高抗逆性被譽為"高能作物"，成為符合我國國情、適合 我國國土和氣候條件、既產能源又產糧食的理想作物之一。加強高粱莖桿生物能源綜合開 發利用，對緩解國家能源緊張、改善生態環境、促進國民經濟穩定持續發展，都具有十分重 要而深遠的意義。
[0004] 我國的高梁產區集中在東北、華北和西北地區，品種資源豐富，這為新品種的選育 奠定了豐厚的遺傳基礎。高產、含糖量高、抗性好、適應性廣的高粱品種是促進高粱生產發 展的核心和基礎。隨著生物技術的發展和市場需求的變化，高粱的育種方法也有了很大發 展。目前我國高粱的育種方法主要有：傳統育種方法、誘變育種法、倍性育種法、分子育種法 等。針對高粱產業化開發的實踐需求，創新育種思路，加快品種選育，為生產提供適宜的新 品種，將有力地推動高粱產業的發展，并且可以促進種植業結構調整和農村經濟發展。
[0005] 花藥培養是利用植物組織培養技術，把發育到一定階段的花藥。通過無菌操作接 種在培養基上，在一系列條件誘導下改變花藥的發育程序，進行有絲分裂，經過脫分化后形 成細胞團，進而形成愈傷組織，經歷再分化發育成完整的單倍體植株的過程。現在花藥培養 集成了雜交育種、誘變育種、細胞學、遺傳學等各種生物科學的內容，是育種學發展的趨勢 之一，利用花藥培養可以明顯的加快育種進程、縮短育種年限。
[0006] 目前小麥、水稻、玉米及木本植物的花藥培養已經取得了成功，而高梁的花藥培養 誘導單倍體的方法和培養基還不完善。培養基是花藥培養的物質基礎，直接關系到培養物 的生長與分化，培養基組分是影響花培成功的一個很重要的因素，多種禾本科作物花培實 驗表明：培養基各組分的合適用量，以及它們之間一定的組合關系，可顯著影響花培效率， 發現和優化組合花藥培養有機附加物質，可進一步提高花藥培養力。
[0007] 在花藥程序中，愈傷組織的誘導培養是水稻花藥培養過程的第一步，也是重點和 難點，而花藥愈傷組織誘導的頻率和質量直接決定著花藥培養的成敗。因此，組合和優化培 養基組分，摸索出實用的花藥誘導培養基配方是實現高粱花藥誘導培養的關鍵。通過多年 高粱花藥培養的摸索和實踐，我們進一步優化了基本培養基配方，并且不斷嘗試加入一些 提高高粱藥誘導力的有機添加物并組合其種類搭配及濃度，最終摸索出了一種高粱花藥高 效誘導培養基配方。我們的研究結果對于進一步推廣和應用高粱單倍體育種和理論研究無 疑有較大的現實意義和實用價值。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一種高粱花藥高效誘導培養培養基，該培養基的配方如下： KNO3 1500 ~1800mg/L，NH4NO3 900 ~1100mg/L，KH2PO4 230 ~270mg/L，CaCl2* 2H20 270 ~330mg/L，MgSO4 120 ~140mg/L，Na2-EDTA 35 ~40mg/L，FeS04· 7H20 26 ~30mg/ L，MnSO4* H 20 10 ~12mg/L，ZnS04· 7H 20 5· 5 ~6. 5mg/L，H3BO3 3· 5 ~4. 5mg/L，KI 0· 9 ~ I. lmg/L，CuS04· 5H20 0· 035 ~0· 045mg/L，CoCl · 6H20 0· 035 ~0· 045mg/L，NaMoO4* 2H20 0.09~0.11mg/L，甲基橫酸乙醋0.5~0.7mg/L，甘氛酸1.8~2.2mg/L，肌醇45~55mg/ L，維生素 BI 0· 45 ~0· 55mg/L，維生素 B6 0· 45 ~0· 55mg/L，煙酸 0· 45 ~0· 55mg/L，D-阿 拉伯糖基-2-去氧已糖0· 2~0· 3g/L，鹿糖32~38g/L，植物凝膠4. 5~5. 5g/L ; 2.4- D 2. 3~2. 7mg/L，激動素 L 4~I. 6mg/L，復酞核酸0· 7~0· 9mg/L，植物硫化激動 素 PSK-α 35 ~45pmol/L，胰島素 4. 5 ~5. 5mg/L，水解蛋白 0· 25 ~0· 35g/L，PH 5. 8 ~ 6. 0〇
[0009] 本發明所述的培養基具有顯著提高高粱花藥出愈率的優點，可以大幅度地提高高 粱花藥培養效率。下面的實施例以及對比實驗可以清楚地反映本發明所述培養基的特點。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1 配制如下配方的培養基： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ L, Na2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L, MnSO4* H 20 llmg/L, ZnSO4* 7H 20 6. Omg/L, H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 O.lmg/L,甲基磺酸乙酯0.6mg/L,甘氨酸2.0mg/L,肌醇50mg/L,維生素 BI 0.5mg/L,維生 素 B6 0.5mg/L,煙酸0.5mg/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L,鹿糖35g/L,植物凝 膠 5. 0g/L ; 2.4- D 2. 5mg/L，激動素 I. 5mg/L，復酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激動素 PSK- a 40pmol/ L，胰島素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。 toon] 選取高粱品種關東青和平原紅作為花藥培養供體，采集主莖上的圓錐花序，其花 藥中的小孢子處于單核晚期，表面消毒后，5°C下低溫預處理2天。用60%的乙醇表面消毒 3分鐘，然后進一步外植體消毒后接種花藥于該誘導培養基，每個培養皿接種30枚花藥，在 溫度為28°C、濕度70%左右的環境下暗培養。愈傷組織形成后（長到2 mm左右)，計算愈傷 組織誘導率，然后轉移入再生培養基。
[0012] 實施例2 配制如下配方的培養基（甲基磺酸乙酯添加濃度的優選）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ L，Na2-EDTA 37. 5mg/L，FeSO4* 7H20 28mg/L，MnSO4* H2O I lmg/L，ZnS04*7H 20 6.0mg/L，H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 0. lmg/ L，甘氨酸 2.0mg/L，肌醇 50mg/L，維生素 BI (X5mg/L，維生素 B6 (X5mg/L，煙酸（X5mg/L， D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L，蔗糖35g/L，植物凝膠5.0g/L; 2.4- D 2. 5mg/L，激動素 I. 5mg/L，復酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激動素 PSK- a 40pmol/ L，胰島素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。
[0013] 甲基磺酸乙酯的添加濃度設置以下8種：0 ;0· I mg/L ;0· 2 mg/L ;0· 3 mg/L ; 0. 4mg/L ；0. 6mg/L ；0. 7mg/L ；0. 8mg/L〇
[0014] 同樣選取該兩個高粱品種作為花藥供體，操作方法、培養方法同實施例1，計算愈 傷組織誘導率。
[0015] 實施例3 配制如下配方的培養基(凝固劑的優選）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ LjNa2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L,MnS04· H 20 llmg/L,ZnS04· 7H20 6. Omg/L, H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 0. lmg/ L，甲基磺酸乙酯0· 6mg/L,甘氨酸2. Omg/L,肌醇50mg/L,維生素 BI 0· 5mg/L,維生素 B6 0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L，鹿糖35g/L; 2.4- D 2. 5mg/L，激動素 I. 5mg/L，復酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激動素 PSK- a 40pmol/ L，胰島素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。
[0016] 凝固劑設置為以下2種：植物凝膠2. 5g/L，瓊脂3. 5g ;瓊脂7g。
[0017] 同樣選取該兩個高粱品種作為花藥供體，操作方法、培養方法同實施例1，計算愈 傷組織誘導率。
[0018] 實施例4 配制如下配方的培養基(肌醇添加濃度的優選）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ LjNa2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L,MnS04· H 20 llmg/L,ZnS04· 7H20 6. Omg/L, H3BO3 4. Omg/L, KI 1.0 mg/L, CuSO4* 5H20 0. 04mg/L, CoCl · 6H20 0. 04mg/L, NaMoO4* 2H 20 0. lmg/ 1^，甲基磺酸乙酯0.611^/1，甘氨酸2.〇11^/1，維生素1310.511^/1，維生素136 0.511^/1，煙酸 0.5mg/L，D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖0.25g/L，蔗糖35g/L，植物凝膠5.0g/L; 2.4- D 2. 5mg/L，激動素 I. 5mg/L，復酞核酸0· 8mg/L，植物硫化激動素 PSK- a 40pmol/ L，胰島素 5.0mg/L，水解蛋白 0.3g/L，PH 5.9。
[0019] 肌醇的添加濃度設置以下 8 種：0 ;10mg/L ;20mg/L ;30mg/L ;40mg/L ;60mg/L ; 70mg/L ;80mg/L。
[0020] 同樣選取該兩個高粱品種作為花藥供體，操作方法、培養方法同實施例1，計算愈 傷組織誘導率。
[0021] 實施例5 配制如下配方的培養基（D-阿拉伯糖基-2-去氧已糖添加濃度的優選）： KNO3 1650mg/L, NH4NO3 1000mg/L, KH2PO4 250mg/L, CaCl2* 2H 20 300mg/L, MgSO4 130mg/ LjNa2-EDTA 37. 5mg/L, FeSO4* 7H 20 28mg/L,MnS04· H 20 llmg/L,ZnS