一種臺灣牛樟無性繁殖技術的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種臺灣牛樟無性繁殖技術。
【背景技術】
[0002]■墻X Cinnamomum kanehirae ZfejO,又名黑樟,為樟科樟屬植物,原產臺灣。主要分布于亞熱帶和熱帶交界處的天然闊葉林帶，其植物組成主要以樟科及殼斗科為主，植物生態學上稱為樟櫟群落。樹干通直、樹體高聳及初生葉顏色多變，深具觀賞價值，是極具發展潛力的景觀樹種。其果實呈僧帽狀，木材以含松油醇為主，具有特殊的香味，且不易腐朽，材質細致，紋理交錯，且刨削容易，為高價值的家具及木刻藝品用材，一直是臺灣雕刻神像的最佳素材。牛樟因樹型粗壯堅實而得名，與櫸木、紅豆杉、檜木、紅檜木及肖楠并稱六大名木。并與臺灣櫸、烏心石、毛柿及黃連木合稱臺灣產闊葉五大木。此外，部分牛樟樹頭結瘤，其橫斷面生成不同形狀之疤痕(如貓蹄形、山水形等)，俗稱花樟，極具裝飾價值，其自從發現牛樟芝僅存在于老齡牛樟樹樹干腐朽的心材內壁，或者存在于枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面，而不會生長在一般樟樹、白樟、陰陽木等類似樹種上，因而牛樟樹木價格上漲，有時更是一木難求。
[0003]目前牛樟天然林因往昔的過度開發以及人為盜伐，僅分布在交通不便之高海拔地區，且多為高齡老樹，結實量少，母樹甚為分散，授粉極為不易，種子的采集也是一項困難工作，因樹體高大不易攀爬，即便獲得種子，其發芽率也不高。臺灣特有的牛樟樹已經瀬臨滅絕危機，已經被臺灣當局列為一級保育類樹種。近年來，由于內地多地引種臺灣牛樟，造成市場上臺灣牛樣苗木供不應求的局面。本發明以臺灣牛樟帶腋芽莖段為外植體，通過外植體消毒、誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗移栽等過程成功獲得了臺灣牛樣離體再植株，建立臺灣牛樟組織培養快速繁殖技術體系，對加快這一優良景觀樹種在內地應用具有重要的促進作用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供出一種臺灣牛樟無性繁殖技術，本發明以臺灣牛樟帶腋芽莖段為外植體，通過外植體消毒、誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗移栽等過程成功獲得了臺灣牛樣離體再植株，建立臺灣牛樟組織培養快速繁殖技術體系，從而實現了本發明的目的。
[0005]本發明的一種臺灣牛樟無性繁殖技術，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:選取牛樟當年生，半木質化，生長健壯、無病蟲害的帶芽莖段于流水下沖洗I?3h，浸泡于3%?5%洗衣粉溶液5?10分鐘，用軟毛刷3%?5%洗衣粉溶液輕輕刷洗材料，再用自來水以滴水的形式沖洗60?90min。在超凈工作臺中以70%?80%乙醇溶液浸泡20?60s,無菌水沖洗3?5次,再用0.1%?0.5%升萊溶液消毒5?15min,然后用無菌水沖洗外植體至無泡沫為止。用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0006](2)誘導培養:剪取步驟(I)獲得的外植體的帶芽莖段并接種到誘導培養基進行不定芽誘導培養。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為1000?15001x，置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養30天后統計誘導情況。
[0007](3)增殖培養:轉接步驟(2)誘導培養得到的不定芽接至增殖培養基進行不定芽增殖培養。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為1000?20001χ，置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養45天后統計增殖情況。
[0008](4)生根培養:從基部切取步驟(3)增殖培養中獲的不定芽并以垂直方式插入至生根培養基中進行誘導生根。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為2000?30001x,置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養30天后統計生根情況。
[0009](5)煉苗移栽:將生根培養基上獲得的具備移栽條件的瓶苗進行煉苗，瓶苗移至常溫下4?5天后，打開瓶蓋2?3天，然后洗去附著于苗根系上的培養基，移栽至盛有由泥炭土:蛭石=1:1組成的移栽培養基質的容器袋中進行培養，移栽前5天用0.3%?0.5%高猛酸鉀溶液對基質噴淋消毒并加蓋薄膜，3天后打開薄膜，翻動基質，移栽前I天將基質淋透水。移栽時需將基質壓實，并進行單株套袋，早晚噴霧，保證生長環境潮濕。移栽7天后剪去塑料袋兩角，14天后完全脫袋移栽，移栽30天后統計成活率。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導培養基為:WPM+0.1?1.0mg/L IBA+1.0?3.0mg/L6-BA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3 )所述的增殖培養基為:WPM+1.0?5.0mg/L6-BA+0.1?0.5mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂 +1.0 ?5.0g/L 蛋白胨，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養基為:WPM+1.0?3.0mg/L ΙΒΑ+0.1?1.0mg/LΝΑΑ+0.1 ?0.5mg/L KT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]本發明的優點是:一種臺灣牛樟無性繁殖技術，牛樟(Cinnamomum kanehiraeHay)為樟科樟屬植物，為臺灣特有常綠闊葉大喬木，樹干通直、樹體高聳及初生葉顏色多變，深具觀賞價值，是一種極具發展潛力的景觀樹種。以臺灣牛樟帶腋芽莖段為外植體，通過外植體消毒、誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗移栽等過程成功獲得了臺灣牛樟離體再植株，建立臺灣牛樟組織培養快速繁殖技術體系，對加快這一優良景觀樹種在內地應用具有重要的促進作用。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0015]實施例1
(I)外植體消毒:選取牛樟當年生，半木質化，生長健壯、無病蟲害的帶芽莖段于流水下沖洗lh，浸泡于3%洗衣粉溶液5分鐘，用軟毛刷3%洗衣粉溶液輕輕刷洗材料，再用自來水以滴水的形式沖洗60min。在超凈工作臺中以75%乙醇溶液浸泡45s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，然后用無菌水沖洗外植體至無泡沫為止，用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0016](2)誘導培養:剪取步驟(I)獲得的外植體的帶芽莖段并接種到誘導培養基進行不定芽誘導培養。接種后置于每天光照13小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養30天后誘導率為87.9%。所述的誘導培養基為:ffPM+0.3mg/L IBA+1.5mg/L 6_BA+25g/L 蔗糖 +4.5g/L 瓊脂，pH 為 5.5。
[0017](3)增殖培養:轉接步驟(2)誘導培養得到的不定芽接至增殖培養基進行不定芽增殖培養。接種后置于每天光照12小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養45天后增殖系數為3.2。所述的增殖培養基為:WPM+3.0mg/L6-BA+0.3mg/L IBA+23g/L 蔗糖 +4.5g/L 瓊脂 +2.0g/L 蛋白胨，pH 為 5.5。
[0018](4)生