含有天然專門促消退介質及其前體的具有抗炎活性的油的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請要求2012年5月10日提交的美國臨時專利申請號61/645, 281的優先權， 其內容明確地通過引用并入。其中引用的所有參考文獻明確地通過引用并入。
技術領域
[0002] 本發明一般地涉及天然產物、炎癥、病理學和醫學的領域。更具體地，本發明涉及 從天然來源得到的專門促消退介質（SPM)和SPM前體，和它們在用于改善炎癥和具有炎癥 性組分的疾病的營養補劑以及藥物和化妝品制劑中的用途。
【背景技術】
[0003] 炎癥是動物做出的一種復雜生物應答，其嘗試除去或中和病原體、刺激劑或細胞 損傷，并開始受損組織的愈合。炎癥的經典身體征狀包括痛（疼痛）、灼熱（熱）、紅（發 紅）、腫（腫脹）和功能喪失（功能缺失）。炎癥應答的起始與多形核白細胞（嗜中性粒細 胞）、單核細胞和組織巨噬細胞的活化有關。這些細胞的活化會啟動由各種小分子和肽介導 的促炎癥性信號傳遞事件的級聯，所述小分子和肽包括前列腺素、白三烯、趨化因子和細胞 因子以及活化的補體因子。這些信號傳遞事件刺激細胞的趨化性、內皮滲透性、血管舒張、 感覺神經的刺激和凝固的活化，這又會導致炎癥的身體征狀。重要的是，現在理解，炎癥的 終止（即消退）也是炎癥應答的一個主動調節部分，其涉及細胞和分子事件的協調集合，以 便恢復組織結構和功能。
[0004] 盡管炎癥是有益的且實際上是良好的健康所必需的，但是它也可以出差錯和造成 疾病。例如，缺血后的再灌注損傷（例如，在心肌梗塞或缺血性中風中）會刺激急性炎癥應 答，該應答可以損傷組織。并且，當除去原始刺激以后正常炎癥應答不能終止（消退）時， 慢性炎癥可以接著發生。慢性炎癥會損傷健康組織，并且可以造成或加重許多不同疾病，包 括、例如，動脈粥樣硬化和血管系統的其它疾病、哮喘、痤瘡、銀肩病、類風濕性關節炎、慢性 阻塞性肺疾病、囊性纖維化、炎性腸病和不同種類的自身免疫病。慢性炎癥還已經與II型 糖尿病、肥胖、阿爾茨海默氏病和癌癥關聯。
[0005] 現在公認炎癥的消退構成一個主動生理學過程，該過程形成炎癥應答的一個組成 部分。隨著炎癥性滲出物的消失以及適當組織結構和功能的恢復，消退由幾種不同的分子 和細胞機制介導。這些包括：炎癥性細胞因子的清除和代謝破壞；抗炎介質諸如轉化生長 因子-β、白介素-10、膜聯蛋白Al和脂氧素 A4的形成；促炎癥性的嗜中性粒細胞的細胞凋 亡；免疫調節性的單核細胞/巨噬細胞和嗜酸性粒細胞的主動募集；和炎癥性白細胞的胞 葬作用和流出。特別有關的是，已經發現，共同地命名為專門促消退介質（SPM)的物質家族 是消退的中樞調節劑。SPM具有有效的抗炎活性（即它們會減少嗜中性粒細胞浸潤），主動 地刺激炎癥性滲出物的除去和消失，促進感染的清除，和刺激傷口愈合。SPM是在炎癥性損 傷的消退滲出物中鑒別出的一類新近表征的脂質介質，并且包含長鏈多不飽和脂肪酸的酶 促氧合衍生物，所述長鏈多不飽和脂肪酸是諸如ω-3多不飽和脂肪酸（U-3PUFA)、二十碳 五烯酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。SPM對特定G蛋白偶聯受體具有有效激動活性，由 此活化炎癥消退的不同方面。SPM由長鏈《-3PUFA-衍生的脂質介質的幾個不同家族組成： 消退素、保護素和maresin-它們中的每一種的成員通過刺激內源性消退機制來控制炎癥 的持續時間和強度（Bannenberg和Serhan, 2010)。
[0006] SPM的生物合成涉及一個或兩個分子的分子氧向多不飽和脂肪酸中的位置摻入和 立體特異性摻入，所述摻入由底物-和位置-選擇性的脂肪酸加氧酶諸如環加氧酶Π 型脂 氧合酶（當被阿司匹林乙酰化時）和幾種細胞色素 P450氧化酶催化。當前最好地理解的 充當SPM形成的底物的PUFA是EPA和DHA。
[0007] SPM的內源性形成的第一步涉及長鏈W-3PUFA以立體化學上確定的方式的酶促 氧合，從而導致特定脂肪酸氫過氧化物的形成。脂肪酸氫過氧化物可以經由幾種生物合成 途徑轉化成SPM。第一種途徑是過氧羥基的還原，以形成對應的單羥基化的脂肪酸。這些 單羥基化產物中的一些充當隨后酶促氧合的中間體前體，以形成二羥基化的和三羥基化的 SPM。例如，17-羥基-二十二碳六烯酸（17-HDHA)，即15-脂氧合酶催化的與DHA的氧合 產物，是4種不同的三羥基化消退素 RvDl、RvD2、RvD3和RvD4的形成的底物。以此方式， 17-HDHA可以被視作SPM前體。在一個不同的生物合成途徑中，首先形成的脂肪酸氫過氧化 物可以酶促地重排以形成環氧化物，并且此后酶促地水解，以形成二羥基化的產物。這樣的 二羥基化的脂質介質的例子是保護素 Dl和maresin 1。
[0008] EPA和DHA因而構成動物和人類體內的內源性底物，從它們進行體內形成，以形成 EPA-和DHA-衍生的消退素（分別是所謂的E-系列和D-系列消退素）和DHA-衍生的保 護素和maresin，它們是在體內具有有效抗炎和消退活化活性的二羥基化的和三羥基化的 EPA和DHA衍生物（Bannenberg和Serhan, 2010)。消退素、保護素和maresin是SPM，并且 充當內源性受體配體或變構調節劑以有效地活化細胞應答，所述應答協調地活化抗炎作用 并且促進、刺激和觸發炎癥的消退。此外，現在還已知EPA和DHA的幾種酶促地形成的環氧 化物衍生物本身同樣具有有效的抗炎活性（Wagner, 2011)，并且被視作這里的SPM。先前文 獻還已經描述了呈它們的游離羧酸形式的幾種PUFA-衍生的脂質介質在鱒魚和鱭魚的細 胞和組織中的存在（Pettitt, 1989 ;Hong, 2005 ;Oh, 2011 ;Raatz, 2011)。SPM 的形成內源性 地發生在生物體內，在幾種組織和細胞類型中，且發生在細胞內。SPM形成的底物是游離羧 酸形式的EPA和DHA ;這些游離脂肪酸已經被磷脂酶從含有EPA和DHA的膜磷脂中釋放。先 前描述了在動物或人類的體外可以發現在活生物體的細胞或組織內天然地形成的SPM。
[0009] 現在已經通過化學合成方法合成了幾種SPM。合成的SPM已經成為描繪由動物體 內的細胞形成的SPM的化學結構和活性的手段。并且，已經通過化學合成方法合成了 SPM 的結構類似物。合成形式的SPM的優點是它們的被良好控制的純度。但是，SPM的化學合 成是一個技術上挑戰性的且昂貴的過程，因為難以得到對于生物活性而言重要的精確立體 化學和雙鍵幾何形狀。因此，非常感興趣的是，接近并得到大量天然生物活性形式的SPM。
[0010] 與本發明特別有關的是，一些單羥基化的和環氧化的（epoxygenated)衍生物構 成具有比EPA和DHA更有效的抗炎活性的生物合成中間體，因為它們在幾種SPM的生物合 成中是比EPA和DHA本身更接近的中間體。這些中間體前體因此被視作SPM前體。
[0011] 重要的是，應當指出，幾種其它的長鏈《-3PUFA，諸如二十二碳五烯酸（ω-3)，也 可以被相同的加氧酶轉化成氧合的衍生物，其中一些衍生物具有顯著的抗炎活性。還存在 長鏈ω-ePUFA-衍生的抗炎的和刺激消退的（促消退的）脂質介質，諸如通過2個酶促氧 合步驟從花生四烯酸形成的脂氧素 A4,通過環加氧酶（其產生具有有效抗炎活性的脫水產 物）從花生四烯酸形成的前列腺素 D2,和從二十二碳五烯酸（ω-6)衍生出的具有抗炎活性 的脂質介質。在這方面重要的是理解，象EPA和DHA -樣，花生四烯酸也是一種必需的長鏈 PUFA，并且通常存在于也含有長鏈ω-3脂肪酸的所有生物體中。
[0012] 盡管現在已知幾種SPM的化學結構，并且已經在不同的炎癥實驗模型中稍微詳細 地研宄了它們的抗炎和促消退活性，但是尚未開發出用于抑制或消退炎癥的含有SPM的營 養補劑、化妝品制劑或經批準的藥物制劑。
[0013] 因為增加的EPA和DHA的血液水平與降低的心血管疾病發病率和發展心血管疾病 的傾向有關，所以含有《-3PUFA的油的口服補充逐漸被用于改善炎癥，具有某種程度的成 功。普遍認為飲食長鏈〇-3PUFA的抗炎潛力與EPA和DHA的組織水平的增加有關。通常 認為增加 EPA和DHA的內源性水平如下有利于抗炎狀態：競爭從〇-6PUFA花生四烯酸（AA) 衍生出的活化炎癥的類花生酸類的內源性形成，具有低得多的炎癥效能和效力的EPA-和 DHA-衍生的3-系列前列腺素和血栓烷的形成，和調節免疫細胞功能的在膜結構域和膜蛋 白內的生物物理學變化。但是，最近的研宄已經證實，長鏈《-3PUFA充當內源性SPM的酶 促形成的內源性底物，其充當自身活性物質以在功能上拮抗炎癥且其主動地促進消退。EPA 和DHA充當自身活性物質（其驅動炎癥的消退）的形成的生理學底物的這種最近認識，提 供了長鏈《-3PUFA對于人健康而言的重要性質的更新理解。現在充分確定，增加的含有 EPA和DHA的食品的消耗會增加這些〇-3PUFA的組織水平。近年來，已經證實，EPA和DHA 的飲食補充實際上允許一些EPA-和DHA-衍生的氧合脂質介質在人類中的內源性形成的可 測量的增加（Anta, 2005 ;Shearer, 2010 ;Mas, 2012) 〇
[0014] 含有ω-3雙鍵的長鏈多不飽和脂肪酸由藻類和其它微生物天然地形成，從而形 成長鏈ω-3脂肪酸（諸如EPA和DHA)的轉移的生體營養鏈的基礎（Gladyshev，2013)。哺 乳動物依賴于通過飲食源（主要通過含有顯著EPA和DHA組織水平的魚的消費，所述魚又 從食物鏈得到這些必需的PUFA)對EPA和特別是DHA的充分供給。包括人類在內的哺乳 動物可以從α -亞麻酸內源性地合成EPA和DHA，但是，該轉化的效率非常有限，并且對于 EPA和DHA的需求而言是不足的。含有EPA和DHA的食品的飲食攝入以及具有含顯著EPA 和DHA水平的油的飲食補充，目前被視作得到日常攝入的適當方式，其可以顯著地增加長 鏈U-3PUFA的水平，并由此得到增加的降低炎癥反應和疾病的強度和持續時間的能力。
[0015] 飲食需求隨著年齡和生命階段而變化，并且因此，EPA和DHA對于人健康而言的必 需性質是條件性的。避免人類對長鏈《-3PUFA的大量需要對天然食物鏈的依賴和增長人 類對長鏈ω-3PUFA充足的總體需求，生物技術的新進展已經允許制備例如轉基因植物和 微生物，它們被賦予生物合成能力以形成長鏈ω-3PUFA諸如EPA和DHA (Petrie，2012)。
[0016] 目前通過制劑的消費來實現含有長鏈ω -3PUFA的油的飲食補充，所述制劑包括 許多不同的呈現。目前采用的油絕大部分（以消費的體積計）由從魚提取的含有EPA和 DHA的油組成，在所述魚中，秘魯鱭魚占大部分。其它油包括從例如鮭魚和鮪魚提取的那些 油。存在多種可得到的不同級別的油，其范圍從已經經過冷榨且已經經歷非常少步驟僅從 油清除存在于油中的有色或有味物質的油，到已經為得到特定長鏈ω -3脂肪酸經過選擇 性濃縮的油。含有適當濃度的長鏈《-3PUFA(通常至多大約30% )或具有通過蒸餾增加至 大約55 %的濃度的魚油，被廣泛地用在營養補劑中，所述營養補劑用于治療例如高甘油三 酯血癥和用于血管和眼健康。從魚油制成的長鏈《-3PUFA濃縮物（其目前可以在制藥產 業的工業規模生產）的一個好例子含有97%的乙酯形式的EPA。
[0017] 涉及脂質化學的一般方法、與油和脂肪酸有關的工業方法、以及常規藥物科學，描 述在：（Remington, 2005 ;Martinez, 2007 ;Gunstone 和 Padley, 1997 ;Shahidi, 2005) 〇
[0018] 魚油工業目前制備許多不同的含有EPA和DHA的油等級。也從其它生物體（諸如 磷蝦、烏賊、藻類、酵母、原生動物）和從轉基因植物提取含有EPA和DHA的油，所述轉基因 植物被賦予編碼酶的基因，所述酶允許生物合成EPA和DHA和其它長鏈ω -3PUFA諸如十八 碳四烯酸（SDA)。在市場上可得到的用于人消費的制劑包括油本身、包囊的油、乳劑和穩定 化的粉劑。在所有情況下，目的是提供飲食添加物和藥物成分，它們用于給人類提供足夠高 的劑量以輔助增加 EPA和DHA的內源性組織水平。盡管EPA和DHA相對快速地吸收和再分 布進特定細胞類型中，但是可以測量循環中的血小板和脂蛋白（在24小時內），普遍接受的 是，EPA和DHA在口服消費以后的健康促進作用需要大量時間，這是由于以下假定的需求： 增加的EPA和DHA的組織水平需要積累，并且需要在數周至數月內每天攝入至少數百毫克 EPA和DHA的劑量。
[0019] 提供EPA和DHA作為用于降低炎癥反應以及預防和治療炎性病癥的必需營養物的 需要的一個特征是，通過飲食食物攝入和特殊補充得到的EPA和DHA向SPM的內源性酶促 轉化是一個多步驟的酶促過程，其包括：磷脂酶對磷脂-結合的EPA和DHA的釋放，繼之以 由特定脂肪酸加氧酶催化的一個或多個酶促氧合反應以形成有活性的SPM。這些過程在健 康條件下適當地起作用，但是，低EPA和DHA組織水平以及身體組織中長鏈多不飽和脂肪酸 向SPM的有限或不足轉化，被認為會促進、誘發炎性病癥和增大的炎癥反應或成為它們的 基礎。
【發明內容】
[0020] 本發明是基于以下驚人發現：專門促消退介質（SPM)和SPM前體存在于從含有長 鏈〇-3PUFA的生物體提取的油中。使用包括下述步驟的方法，可以生產含有至少一種SPM 或SPM前體且具有抗炎或刺激消退（促消退）活性的油：測量SPM或SPM前體在含有長鏈 〇-3PUFA的油（諸如粗制的、精制的或濃縮的含有長鏈ω-3脂肪酸的油）中的存在或水 平，將所述油分級分離（fractionate)成多個級分，測量油級分的抗炎或刺激消退活性，和 任選地重復這3個步驟，以得到含有或富含至少一種SPM或SPM前體且具有抗炎或刺激消 退活性的油。SPM和SPM前體可以以可皂化物質的形式存在。此外，所述油可以含有長鏈 ω -3PUFA，諸如 EPA 和 DHA。
[0021] 可以用于這樣的分級分離的技術包括提取和分離方法。用于得到含有或富含SPM 和SPM前體的油的特別重要的技術是采用二氧化碳作為溶劑的超臨界流體萃取（SFE)和超 臨界流體色譜法（SFC)。有效量的這些油向受試者的施用構成減少炎癥或刺激炎癥消退的 方法。所述油可以用于制備營養補劑、藥物制劑和化妝品制劑，其包含有效量的具有抗炎或 刺激消退活性的油。這些補劑和制劑因而構成可以大量制備的抗炎和促消退組合物，且不 需要加入昂貴的化學合成的SPM。
[0022] 盡管與本文描述的那些類似或等效的方法和材料都可以用于實踐或試驗本發明， 但是下面描述了適合的方法和材料。在本文中提及的所有專利、專利申請和出版物通過引 用整體并入。在沖突的情況下，以本說明書（包括定義）為準。另外，下面討論的特定實施 方案僅僅是示例性的，且無意成為限制性的。本領域技術人員考慮到本發明的描述會明白 本發明的其它方面。
【附圖說明】
[0023] 從結合附圖做出的下述詳細描述，將會更清楚地理解本發明的上述和其它目的、 特征和優點，在附圖中：
[0024] 圖IA-H顯示了 口服施用一系列連續洗脫的油級分（分別編號1-8)以后對通過 脂多糖（LPS)的皮下（s.c.)施用誘導的小鼠中皮下地發生的急性炎癥性變化的影響，所 述油級分通過中間體長鏈《-3PUFA-乙酯濃縮物（含有70 %的組合的EPA-乙酯（EE)和 DHA-EE)的工業規模SFC分級分離得到。
[0025] 圖2顯示了中間體長鏈〇-3PUFA-乙酯濃縮物（含有70%的組合的EPA-EE和 DHA-EE)的工業規模SFC分級分離的連續洗脫的油級分中，多不飽和脂肪酸EPA和DHA的乙 酯化和可皂化形式的不同單羥基化衍生物的相對豐度。編號1-8的級分與如在圖1中所示 的試驗抗炎活性的那些相同。
[0026] 圖3A.顯示了中間體長鏈〇-3PUFA-乙酯濃縮物（含有70%的組合的EPA-EE和 DHA-EE)的工業規模SFC的幾種連續洗脫的油級分（對應于如在圖1和2中所示的相同級 分）中的D-系列消退素前體17-HDHA的乙酯的濃度。
[0027] 圖3B.顯示了發現在級分1中富含的17-1-HDHA-乙酯的手性高效液相色譜法-三 級四極桿質譜分析的結果，進行該分析以確定堿性水解以后得到的乙酯油級分1-8中的立 體異構體17S-HDHA和17R-HDHA的相對豐度（上圖）。
[0028] 圖4顯示了在通過腹膜內施用酵母膜提取物酵母多糖A誘導的腹膜炎癥的鼠模型 中，通過管飼法施用的油級分1和17S-HDHA的抗炎效應。
[0029] 圖5A-C證實了幾種特定的SPM和SPM前體在不同油級分中的存在。
[0030] 圖6A-B表明，通過長鏈Q-3PUFA濃縮物的SFC分級分離，可以實現特定SPM和 SPM前體的選擇性富集。
[0031] 圖7顯示了通過含有SPM前體的油刺激的炎癥的消退。
【具體實施方式】
[0032] 已經發現