一種抗銹病黑楊組培苗的繼代培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種黑楊組培苗的繼代培養方法。
【背景技術】
[0002] 落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina)又稱青楊葉銹菌，是一種分布 廣，危害大的長生活史轉主寄生銹菌，其引起的楊樹葉銹病是楊樹（Populus spp.)苗期和 幼樹階段的重要葉部病害，可侵害青楊派、黑楊派及其雜交種的20多種楊樹，發生最為普 遍，為楊樹5大嚴重病害之首。落葉松-楊柵銹菌存在生理分化現象，目前為止，已經發現 的生理小種包括E1、E2、E3,以及后來發現的生理小種E4等。通常，黑楊（Populus nigra) 及其雜交后代具有對銹菌的抗性。經過接種試驗篩選出抗銹菌的黑楊，在組培擴繁過程中 遇到褐化、玻璃化以及繼代培養后抗性缺失等問題。本發明所選用的技術能夠保證20次繼 代培養后抗性不缺失。
【發明內容】
[0003] 本發明是要解決目前組培擴繁過程中及繼代培養后抗銹病的抗性易缺失的問題， 提供一種抗銹病黑楊組培苗的繼代培養方法。
[0004] 本發明抗銹病黑楊組培苗的繼代培養方法，按以下步驟進行：
[0005] -、抗銹病黑楊篩選：
[0006] 從活化培養的1年生黑楊休眠枝條上分離出葉間隔期指數為5~9的完全展開的 葉片，每株黑楊取葉片8~12片，接種銹菌，然后將接種葉片置于16°C的生長室，每天進行 16h光照，持續培養7天，計算每株黑楊的病情指數，選擇病情指數〈25的黑楊植株，對黑楊 葉片進行清洗與消毒，接種到含300mg/LAmp的1/2MS固體培養基上，進行繼代培養20天， 篩選出繼代培養20天后病情指數〈25的黑楊植株為抗銹病黑楊；
[0007] 二、抗銹病黑楊組培苗的繼代培養：
[0008] 將步驟一篩選得到的抗銹病黑楊組培苗在無菌操作條件下通過切分叢生芽的形 式進行擴繁增殖，將高度為1. 5~2. 5cm的叢生芽接種到繼代培養基上，于溫度25°C，光照 強度為1000~1500Lux，光照時間為24h/d的條件下進行培養。
[0009] 本發明所述抗銹病黑楊組培苗的繼代培養方法，可保障黑楊組培苗順利繼代培 養，并保持對銹菌抗性20代。在抗病種苗擴繁和生產中有助于實現規模化生產，實現本發 明的目的。本發明通過改良培養基配方和操作技術實現繼代培養20代后保持抗性，在楊樹 抗病育種和種苗快速繁殖中具有重要的應用價值。
【具體實施方式】
[0010] 本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
[0011]
【具體實施方式】一：本實施方式抗銹病黑楊組培苗的繼代培養方法，按以下步驟進 行：
[0012] -、抗銹病黑楊篩選：
[0013] 從活化培養的1年生黑楊休眠枝條上分離出葉間隔期指數為5~9的完全展開的 葉片，每株黑楊取葉片8~12片，接種銹菌，然后將接種葉片置于16°C的生長室，每天進行 16h光照，持續培養7天，計算每株黑楊的病情指數，選擇病情指數〈25的黑楊植株，對黑楊 葉片進行清洗與消毒，接種到含300mg/LAmp的1/2MS固體培養基上，進行繼代培養20天， 篩選出繼代培養20天后病情指數〈25的黑楊植株為抗銹病黑楊；
[0014] 二、抗銹病黑楊組培苗的繼代培養：
[0015] 將步驟一篩選得到的抗銹病黑楊組培苗在無菌操作條件下通過切分叢生芽的形 式進行擴繁增殖，將高度為1. 5~2. 5cm的叢生芽接種到繼代培養基上，于溫度25°C，光照 強度為1000~1500Lux，光照時間為24h/d的條件下進行培養。
[0016]步驟一所述銹菌為落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina)，于2003 年在〈〈Quantitative inoculations of poplars with Melampsora larici-populina. European Journal of Plant Patho 1 ogy》（M. H. Pe i，C. Ru i z，J. Harr i s, T. Hunter. ,2003, 109:269-276.)中公開，由文章作者M.H. Pei惠贈，保存于東北林業大學森 林保護學科森林病理學標本室。
【具體實施方式】 [0017] 二：本實施方式與一不同的是：步驟一中接種銹菌的 方法為：用質量百分濃度為0. 004%的Tween 20水溶液懸浮孢子，然后進行噴霧接種，其中 孢子濃度為40000個/mL。其它與一相同。
【具體實施方式】 [0018] 三：本實施方式與一或二不同的是：病情指數的計算 方法為：病情指數=l〇〇X E (各級病葉數X各級代表值V(調查總葉數X最高級代表 值），病情指數〈25為抗病，25〈病情指數〈50為中度抗病，50〈病情指數〈75為感病，75〈病 情指數為高感病；其中病級及各級代表值為：葉片無夏孢子器產生為1級，代表值為〇 ;葉 片1/4以下面積有夏孢子器產生為2級，代表值為1 ;葉片1/4~1/2面積有夏孢子器產生 為3級，代表值為2 ;葉片1/2~3/4面積有夏孢子器產生為4級，代表值為3 ;葉片表面3/4 以上面積有夏孢子器產生為5級，代表值為4。其它與一或二相同。
[0019]
【具體實施方式】四：本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是：步驟一中繼 代培養的條件為25°C，光照強度1000~1500LUX。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。 [0020]
【具體實施方式】五：本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是：步驟二中繼 代培養基為含有〇. lmg/L激動素、0. lmg/L 6-芐基氨基嘌呤、0.025mg/L苯基脲衍生物TDZ、 吲哚丁酸〇. 3mg/L、8g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS培養基，pH為5. 8~6. 2。其它與具體實 施方式一至四之一相同。
【具體實施方式】 [0021] 六：本實施方式與一至五之一不同的是：步驟二中光 照強度為1200~1300Lux。其它與一至五之一相同。
[0022] 實施例1 :
[0023] 本實施例抗銹病黑楊組培苗的繼代培養方法，按以下步驟進行：
[0024] -、抗銹病黑楊篩選：
[0025] 從活化培養的1年生黑楊休眠枝條上分離出葉間隔期指數（LPI)為7的完全展開 的葉片，每株黑楊取葉片10片，接種銹菌，接種銹菌的方法為：用質量百分濃度為〇. 004% 的Tween 20水溶液懸浮孢子，然后進行噴霧接種，其中孢子濃度為40000個/mL。同時設置 對照組，對照組使用含0. 004% Tween 20的去離子水進行噴霧，然后將接種葉片置于16°C 的生長室，每天進行16h光照，持續培養7天，計算每株黑楊的病情指數，選擇病情指數〈