一種土沉香組織培養再生體系的建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種土沉香組織培養再生體系的建立方法。
【背景技術】
[0002]土沉香(又稱白木香、堯香、女兒香等,為瑞香科沉香屬多年生常綠喬木，是我國特有而珍貴的藥用植物和香料植物，也是我國生產沉香的唯一植物資源。目前零星分布于廣東、廣西、福建、海南、臺灣等地。土沉香不但具有極高的藥用與經濟價值，而且樹形美觀、樹姿優雅、枝繁葉茂、四季常綠，是一種觀賞價值頗高的園林綠化樹種。近年來由于人們對沉香的無度索取，致使土沉香天然林遭到嚴重破壞，加之天然林更新能力弱，國內土沉香野生資源已近枯竭，現僅有零星散生分布，資源現狀不容樂觀，已被列為國家二級重點保護野生植物。
[0003]近年來，土沉香人工林得到迅猛發展，但一般采用種子苗造林。因遺傳變異大，生產量差異較大。此外，土沉香野生優樹結實率低，不易獲得大量優質種子，且種子不宜保存，易喪失活力，使得通過有性繁殖經營及發展人工林的進程變得緩慢和困難。采用植物組織培養繁殖技術，可以在一定程度上保留母本的優良性狀，增加良種的繁育能力和數量，已經成為保護和繁殖珍貴樹種的有效措施之一。因此，通過植物組織培養技術，能夠有效解決種子不足問題，為土沉香資源保存和開發利用開辟新的途徑，也為土沉香無性系育種提供一種技術手段。本發明以土沉香當年生頂芽為外植體，通過愈傷組織誘導培養、分化、增殖培養、生根培養、煉苗移栽等過程成功獲得了土沉香離體再植株，建立土沉香組織培養快速繁殖技術體系，為無性系育種及有效保護土沉香資源，加速組培苗生產，滿足市場需求做出貢獻。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供出一種土沉香組織培養再生體系的建立方法，本發明以土沉香當年生頂芽為外植體，通過愈傷組織誘導培養、分化、增殖培養、生根培養、煉苗移栽等過程成功獲得了土沉香離體再植株，建立土沉香組織培養快速繁殖技術體系，從而實現了本發明的目的。
[0005]本發明的一種土沉香組織培養再生體系的建立方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:選取生長旺盛、健壯、無病蟲害的2年生海南種源土沉香苗木的頂芽。用3%的洗衣粉水清洗10?30min，流水沖洗30?60min。在超凈工作臺中，以70%?80%乙醇溶液浸泡20s?60s，無菌水沖洗4?6次，再用0.1%?0.2%升汞溶液消毒5?15min，然后用無菌水沖洗外植體至無泡沫為止。把消毒好的外植體置于鋪有無菌濾紙的盤中，吸干材料表面的水分。
[0006](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)消毒好的頂芽切掉末端與藥液接觸的部分，再切成3.0cm左右的小段并接種到誘導培養基進行愈傷組織誘導培養。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為1000?20001x，置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養30天后統計誘導情況。
[0007](3)分化培養:將步驟(2)誘導得到的愈傷組織取出切成直徑大小約0.5cm的塊接種至分化培養基進行分化培養。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為2000?30001x,置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養30天后統計分化情況。
[0008](4)增殖培養:選取步驟(3)分化培養得到的不定芽接種至增殖培養基進行繼代培養。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為1000?20001x，置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養30天后統計增殖情況。
[0009](5)生根培養:從基部切取步驟(4)增殖培養中獲的健壯不定芽接種至生根培養基中進行誘導生根。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為2000?30001χ，置于培養溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養30天后統計生根情況。
[0010](6)煉苗移栽:將生根培養基上獲得的具備移栽條件的瓶苗進行煉苗，瓶苗移至常溫下4?5天后，打開瓶蓋2?3天，然后洗去附著于苗根系上的培養基，移栽至盛有由泥炭土:蛭石=1:1組成的移栽培養基質的容器袋中進行培養，移栽前5天用0.3%高猛酸鉀溶液對基質噴淋消毒并加蓋薄膜，3天后打開薄膜，翻動基質，移栽前I天將基質淋透水。移栽時需將基質壓實，并進行單株套袋，早晚噴霧，保證生長環境潮濕。移栽7天后剪去塑料袋兩角，14天后完全脫袋，移栽30天后統計成活率。
[0011]上述步驟(2 )所述的誘導培養基為:MS+0.05?0.2mg/L ΝΑΑ+0.5?2.0mg/L6-BA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的分化培養基為:MS+0.1?1.0mg/L 6-BA+0.01?0.1mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(4)所述的增殖培養基為:MS+0.1?1.0mg/L ΚΤ+0.01?0.1mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(5)所述的生根培養基為:1/2MS+1.0?2.0mg/L ABT5+0.01?0.lmg/LNAA+0.1 ?1.0mg/L IBA+15 ?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂 +1 ?3g/L 蛋白腺 +50 ?100ml/L 椰子汁，pH 為 5.4 ?5.8。
[0015]本發明的優點是:土沉香sinensis)為瑞香科沉香屬多年生常綠喬木，是我國特有珍貴的藥用樹種，具有較高的經濟價值及園林、綠化等生態價值。因過度的采集沉香，野生土沉香趨于瀕危，已被列入國家珍稀瀕危三級保護植物以及國家二級重點保護野生植物名錄。因此，為了更好地保護土沉香樹種，研究和建立完善的組培快繁體系具有重要的現實意義。本發明以土沉香當年生頂芽為外植體，通過愈傷組織誘導培養、分化、增殖培養、生根培養、煉苗移栽等過程成功獲得了土沉香離體再植株，建立土沉香組織培養快速繁殖技術體系，為無性系育種及有效保護土沉香資源，加速組培苗生產，滿足市場需求做出貢獻。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0017]實施例1 (I)外植體消毒:選取生長旺盛、健壯、無病蟲害的2年生海南種源土沉香苗木的頂芽。用3%的洗衣粉水清洗lOmin，流水沖洗30min。在超凈工作臺中，以70%乙醇溶液浸泡40s，無菌水沖洗6次,再用0.1%升汞溶液消毒15min，然后用無菌水沖洗外植體至無泡沫為止。把消毒好的外植體置于鋪有無菌濾紙的盤中，吸干材料表面的水分。
[0018](2)愈傷組織誘導:將步驟(I)消毒好的頂芽切掉末端與藥液接觸的部分，再切成3.0cm左右的小段并接種到誘導培養基進行愈傷組織誘導培養。接種后置于每天光照12小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養30天后誘導率為86.67%。所述的誘導培養基為:MS+0.08mg/L NAA+1.2mg/L 6_BA+25g/L蔗糖+4.5g/L 瓊脂，pH 為 5.5。
[0019](3)分化培養:將步驟(2)誘導得到的愈傷組織取出切成直徑大小約0.5cm的塊接種至分化培養基進行分化培養。接種后置于每天光照12小時，光照強度為20001χ，置于培養溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養30天后分化率為90%。所述的分化培養基為:MS+0.3mg/L 6-BA+0.05mg/LNAA+30g/L 蔗糖 +3.8g/L 瓊脂，pH 為 5.5。
[0020](4)增殖培養:選取步驟(3)分化培養得到的不定芽接種至增殖培養基進行繼代培養。接種后置于每天光照12小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養30天后增殖系數為10.5。所述的增殖培養基為:MS+0.8mg/LKT+0.06mg/LNAA+18g/L 蔗糖 +4.5g/L 瓊脂，pH 為 5.5。
[0021](5)生根培養:從基部切取步驟(4)增殖培養中獲的健壯不定芽接種至生根培養基中進行誘導生根。接種后置于每天光照12小時，