一種高蟲草素含量的北蟲草菌株選育方法及生產工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及北蟲草菌株選育方法領域，尤其涉及一種高蟲草素含量的北蟲草菌株 選育方法及生產工藝。
【背景技術】
[0002] 北蟲草又稱為蛹蟲草、北冬蟲夏草，隸屬于真菌界的子囊菌門、肉座菌目、麥角菌 科，是蟲草屬的模式種，與冬蟲夏草屬同種，全球廣泛分布。北蟲草在鱗翅目昆蟲上的子囊 座與蟲體的藥用價值與冬蟲夏草相似，是我國極具開發價值的藥用滋補真菌，可以作為冬 蟲夏草的代用品。近年來隨著研宄人員對北蟲草滋補保健功效和多種藥用價值的認識，其 開發利用研宄倍受關注，并在藥理有效成分及人工栽培等各方面取得了很大的進展。現在 主栽食用菌品種育種工作開展的很多，但是北蟲草新菌株的選育工作報道較少。現在市場 上北蟲草商品多為尖頭和棒狀品種，而市場對子囊座膨大狀同時蟲草素高的商品草有需 求。
[0003] 真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎。已知真菌的交配型 系統分為同宗配合和異宗配合2大類。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式，即該 真菌不需要兩個不同來源的菌絲交配，只由同一有性孢子萌發生成的初級菌絲就可獨立 完成有性生活史。同宗配合分成初級同宗配合（primaryhomothallism)和次級同宗配 合（secondaryhomothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式，S卩由同一有 性孢子萌發形成的初級菌絲不能獨立完成有性生活史，只有通過兩個不同交配型的有性 孢子萌發生成的初生菌絲之間的交配，才能完成有性生活史。異宗配合根據控制交配型 的不親和性因子是一對還是兩對，也可分為兩類：具有一對不親和性因子的二極性異宗配 合（bipolarheterothallism)和具有兩對不親和性因子的四極性異宗配合（tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產生的有性孢子間的交配而言，二極性異宗配合菌的可親 和率為50%，而四極性異宗配合菌的可親和率為25%，北蟲草屬于二極性異宗配合真菌， 在有性生殖過程會帶來遺傳重組缺失突變等，使有性后代發生各種變異，通過子囊孢子的 分離和配對雜交，使我們有可能從中篩選到子囊座膨大蟲草素高的北蟲草。
[0004] 北蟲草在有性生殖過程中往往會發生染色體水平和基因水平上遺傳變異染色體 水平上的變異，主要是因為蟲草在有性生殖過程中發生質配核配和減數分裂所致；而基因 水平上的變異主要是由于蛹蟲草在生長過程中受到營養條件和環境條件的誘變所致，所以 即使是來自同一子實體的不同子囊孢子菌株間在菌落顏色形態生長速率等性狀上也存在 一定差異，各自產生子實體的能力也不盡相同。試驗表明菌落顏色為杏橙色的單孢子一般 是可孕的而且產子實體的能力較強，配對后比單獨培養時產子實體的能力更強，菌落顏色 為淡檸檬黃色的單孢子一般是不可孕的，配對后一部分是可孕的有些產子實體的能力也很 強，將單孢子對峙培養后發現在單孢子間有扇形雜交區的配對培養產生子實體的能力強， 沒有扇形雜交區的單孢子配對培養產生子實體的能力弱。
[0005] 現有技術通過組織分離（北蟲草菌種的培育方法，CN102550290A;北蟲草 最佳組織分離期篩選方法，CN103250566A;蛹蟲草優良菌種的篩選和穩定繁殖方法，CN1710063)、分生孢子雜交（利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產量的方法， CN103609331A;)、多孢雜交（一種蛹蟲草菌種的培養方法，CN102017866A)可以基本實現普 通北蟲草和孢子粉的生產。但組織分離由于多次的無性繁殖，菌株中含有大量的衰退變異 菌，使菌種活力明顯降低，表現為生長變慢、轉色變慢、產量下降等；利用分生孢子和多孢雜 交存在菌株純度不足，出草良品率低等問題。
[0006] 鑒于上述缺陷，本發明創作者經過長時間的研宄和實踐終于獲得了本創作。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種高蟲草素含量的北蟲草菌株選育方法及生產工藝，用 以克服上述技術缺陷。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供一種高蟲草素含量的北蟲草菌株選育方法，該具體 過程為：
[0009] 步驟a，優良單孢子菌株選育；
[0010] 將成熟子實體倒懸于PDA培養基上方，自然彈射，18-22°c避光培養2-3天，可見星 芒狀萌發點，選取單個萌發點，挑取多于100株于PDA斜面培養基上；20-23°C避光培養15 天后，光照3天，選擇30株在PDA斜面培養基上萌發快、長勢旺，菌絲粗壯，見光轉色快，色 濃的菌株，轉接至培養皿，20-23°C避光培養，挑選20株準備子實體培養；
[0011] 步驟b，制備液體菌種；
[0012] 取500ml三角瓶，每瓶加200ml液體培養基，接種約0. 5cm2斜面菌種，置搖床 16-23°C避光培養，100r?mirT1震蕩培養4天；觀察液體是否渾濁，若渾濁則剔除；
[0013] 步驟c，出草實驗；
[0014] 將所得的液體菌種通過一定比例配對轉接于瓶裝小麥培養基上，于18-20°C避光培養7-15天，菌絲長滿培養基后，培養溫度調制20-23 °C，見光培養，光照強度 5001X-20001x，持續光照1-3天，轉色后在膜上打孔通風，光照改為每天12小時，濕度控制 在65-85 %，培養40天后，選擇子囊座膨大顯著采收并測定蟲草素含量；
[0015] 步驟d，選擇子囊膨大狀菌株；
[0016] 觀察成熟子實體子囊座膨大程度，選取子囊座膨大顯著且蟲草素含量高的菌株， 從子囊座組織分離得到純化菌株，轉接到PDA斜面培養基，采用小麥培養基再次進行出草 試驗；若上述20株菌株未出現子囊座膨大的菌株，則繼續將剩余的菌，繼續進行出草試驗， 篩選子囊座膨大蟲草素含量高菌株；
[0017] 觀察成熟子實體子囊座膨大程度，選取子囊座膨大顯著的菌株，從子囊座組織分 離得到純化菌株，轉接到PDA斜面培養基，采用小麥培養基再次進行出草試驗；若上述20株 菌株未出現子囊座膨大的菌株，則繼續將剩余的菌，繼續進行出草試驗，篩選子囊座膨大蟲 草素含量高菌株。
[0018] 進一步地，上述步驟b中的液體培養基為：玉米粉1-3%、土豆1-3%、葡萄糖 1-3%、蛋白胨 0? 1-3%、磷酸二氫鉀 0? 05-0. 5%、硫酸鎂 0? 01-0. 05%、水 89-96. 9%，121°C 滅菌30min。
[0019] 進一步地，上述步驟c中的小麥的固體培養基：小麥1000g、豆柏10-100g、葡萄 糖10-50g、蛋白胨10-50g、磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂0. 1-0. 5g、磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂 0? 1-0. 5g、VB2-片、VB6-片、含水量 55-65%，121°C滅菌 30min。
[0020] 本發明還提供一種高蟲草素含量的北蟲草菌株的生產工藝，該具體過程為：
[0021] 步驟al，制作培養基，其配方為：小麥1千克，豆柏0. 05千克，蟲草專用促生劑35 克，水1. 5千克；
[0022] 步驟a2,配制方法：將蟲草專用促生劑放入水中，攪至完全溶解即成營養液；每盒 小麥按450克、水0. 7升分裝入塑料盒；分裝完后用耐高溫塑料膜將每個塑料盒蓋嚴并用耐 高溫松緊繩扎一道；
[0023] 步驟a3,滅菌：滅菌鍋內加適量水，把培養料盒放入滅菌鍋，升溫至100°C-121 °C， 保持1-8小時；取出，冷卻后移入接種室；用優質氣霧消毒劑或常規方法密閉消毒30分鐘， 即可穿戴消毒衣服進入接種室接種；
[0024] 步驟a4,接種：進入接種室應迅速關好門；接種工具、菌種外壁、操作人員雙手，用 75%酒精擦拭或浸沾消毒；采用液體菌種；在無菌條件下，打開封口材料，用接種槍將液體 種噴勾即可；接種量視容器大小而定，或在液體菌種中加入一定比例的無菌水或無菌營養 液再接種的；
[0025] 步驟a5,管理：萌發室內最初將溫度保持16_20°C遮光萌發8-15天；當菌絲生長 至培養基1/2-2/3時，將溫度升至20°C并進行劃菌；將盒從萌發室轉入培養室，每天24小 時光照轉色1-3天，當培養基轉為橘紅和出現菌絲突起時，給予10_15°C的溫差刺激，溫度 提高到20-23°C;對培養室消毒30分鐘，然后在塑料膜上用工具點6-18個孔，濕度保持 65-85%，室內適量通氣為子座生長提供足夠氧氣；
[0026] 步驟a6,采收：子座呈橘紅色或橘黃色球狀不再生長時，總培養時間控制在50-70 天；打開盆口用小刀或剪刀將其從基部采下，放入潔凈器具內及時烘干或晾干，勿暴曬以免 褪色，干燥后存放。
[0027] 與現有技術相比本發明的有益效果在于，本發明技術能夠實現北蟲草品種的多樣 化，優選出子囊座膨大且蟲草素含量高的北蟲草菌；外形似蝌蚪，具有很好的市場前景。由 于菌種的特殊性，工業化生產要求