多粘類芽孢桿菌dgnkzx004在口紅花栽培方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及多粘類芽孢桿菌dgnkzx004在口紅花 栽培方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花卉在生長過程中，可能遭遇到各種自然災(zāi)害，造成植物生長發(fā)育不良，甚至植物 色澤暗淡，葉枯、花腐、器官畸形、莖干枯，從而降低了花卉產(chǎn)量和質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損 失。引起花卉病害的主要原因有環(huán)境原因和病蟲害原因。環(huán)境原因主要引起生理病害，是 由于氣候和土壤等條件不適宜引起的，常發(fā)生的生理病害有夏季強光照射引起的灼傷，冬 季低溫造成的凍害，水分過多導(dǎo)致爛根，水分不足引起葉片焦邊、萎蔫，土壤中缺乏某些營 養(yǎng)元素，出現(xiàn)缺素癥等等。病蟲害則是由病菌及病蟲引起的。這些生物大多具有寄生力和 致病力，并具有較強的繁殖力，能從感病植株通過各種途徑蔓延到健康植株上去，在適宜的 環(huán)境條件下生長、發(fā)育、繁殖、傳播，周而復(fù)始，逐步擴大蔓延，因此，這類病害對花卉造成的 危害最大。其中，真菌是沒有葉綠素具有真核的低等生物，它以菌絲體為營養(yǎng)體，以孢子進 行繁殖，是花卉病害中最主要的一類。
[0003] 花卉病蟲害防治，必須遵循"預(yù)防為主，綜合防治"的基本原則。預(yù)防為主，就是根 據(jù)病蟲害發(fā)生規(guī)律，針對薄弱環(huán)節(jié)和防治的關(guān)鍵時期，采取有效，可行的方法，在病蟲害大 量發(fā)生或造成危害之前，予以控制，使其不能發(fā)生或蔓延，保護花卉免受損失或少受損失。 綜合防治，就是從生產(chǎn)和生態(tài)的全局觀出發(fā)，充分利用自然界抑制病蟲害的各種因素，創(chuàng)造 不利于病蟲害發(fā)生的條件，采取各種必要的防治措施，以栽培技術(shù)防治為基礎(chǔ)，根據(jù)病蟲害 發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，因地制宜，合理應(yīng)用生物、物理、化學(xué)等防治措施，有效地控制病蟲害發(fā) 生，將其造成的損失減少到最低水平。溫室花卉病蟲害生物防治，多是利用捕食性天敵、寄 生性天敵、微生物農(nóng)藥、各種抗生素以及害蟲性外激素等進行防治；物理防治則多使用覆蓋 薄膜、紗網(wǎng)阻隔、色板(膜、紙）誘殺等方法；化學(xué)防治使用化學(xué)藥劑來抑制或殺死病蟲或病 菌。其中以生物防治的安全性和持久性最好，是一種綠色、安全、環(huán)保、有效的防治手段。
[0004] 生物防治是指利用自然界各種無害的生物或其代謝產(chǎn)物進行病蟲害防治。生物防 治通過生物間的相互作用來控制病蟲害，其效果可能不能像化學(xué)農(nóng)藥那么快速、有效，但 它們的防效是持久的、穩(wěn)定的，且是環(huán)境友好的。目前生物防治的基本途徑主要有：天敵昆 蟲的保護利用、昆蟲性信息素與不育性的利用、生物農(nóng)藥的應(yīng)用、拮抗微生物和害蟲致病微 生物的利用、轉(zhuǎn)基因技術(shù)抗蟲抗病等。其中，利用微生物對病害進行防治是一種很好的方 式。微生物種類豐富、代謝途徑多樣，并能產(chǎn)生對自然界病害菌有拮抗作用的活性物質(zhì)。
[0005] 多粘類芽孢桿菌是土壤中常見的細菌，也是一類重要 的病害生物防治微生物，有一些還具有刺激植物生長的特點。大量研究表明，有些多粘類芽 孢桿菌除了可以直接抑制植物病原菌，還能通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)如抗菌蛋白質(zhì)或酶、誘導(dǎo)寄 主的抗病能力等。對于多粘類芽孢桿菌誘導(dǎo)寄主的抗病能力機制的研究越來越受到重視， 2004年童蘊慧等公開了利用多粘類芽孢桿菌菌株處理番爺 葉片，對灰霉病有明顯的誘導(dǎo)抗病作用。而目前尚未見有多粘類芽孢桿菌抑制花卉病菌及 應(yīng)用于花卉栽培的報道和研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有口紅花栽培技術(shù)的缺陷和不足，提供多粘類 芽孢桿菌菌株dgnkzx004在口紅花栽培方面的應(yīng)用。該菌株 不僅對多主棒孢菌具有顯著的抑制作用，還能夠促進口紅花的生長，可以很好地應(yīng)用于口 紅花的栽培。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于口紅花生物防治和/或促生長的復(fù)合菌劑。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzx004在抑制多 主棒孢菌（cassiico/a)方面的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還提供了多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzx004在 口紅花栽培方面的應(yīng)用，所述應(yīng)用是應(yīng)用于防治口紅花葉斑病和/或促進口紅花生長方 面，尤其是應(yīng)用于毛萼口紅花的生物防治及促生長方面。
[0010]上述多粘類芽抱桿菌（ZbefliAaciBw1S 菌株dgnkzx004 于 2014 年 10 月 21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏號是CCTCCM2014504,也已在申請?zhí)?為201410630169. 5的專利中公開。
[0011] 本發(fā)明提供了一種用于口紅花生物防治和/或促生長的復(fù)合菌劑，是以多粘類 芽孢桿菌菌株dgnkzx004的菌體為有效活性成分，配合甲殼素制備得到。溶劑可以為水 或者多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzX〇04的液體培養(yǎng)基等。從更適宜保存的角度考慮，使用 dgnkzx004的液體培養(yǎng)基更有利于菌株的生存和繁殖。
[0012] 所述復(fù)合菌劑中多粘類芽孢桿菌dgnkzx004的終濃度為IO8~10 9CFU/mL，甲殼素 的體積百分濃度為〇. 5~2%。
[0013] 優(yōu)選地，所述復(fù)合菌劑中多粘類芽孢桿菌dgnkzx004的終濃度為7~8XIO8CFU/ mL，甲殼素的體積百分濃度為1%。
[0014] 本發(fā)明通過長期大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌dgnkzxOO及其復(fù)合菌劑 不僅對引起口紅花葉斑病的多主棒孢菌具有明顯、穩(wěn)定的抑菌效果，還能夠促進口紅花的 生長。因此，在口紅花的生物防治及促生長方面具有重要的應(yīng)用價值，能獲得很好的效果， 其中對毛萼口紅花的效果最為突出。
[0015] 本發(fā)明上述的多粘類芽抱桿菌菌株dgnkzx004是本 發(fā)明人從東莞農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心果園土壤中采集分離所得，已于2014年10月21日保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏號是CCTCCM2014504。
[0016] 具體地，本發(fā)明人在荔枝果園，選用對角線法和棋盤法采樣。確定取土地點后，除 去上面的枯枝落葉層以及地表5cm左右的浮土；之后用鏟斜向下(離地表5~15cm深度的 土壤）切取一片片的土壤樣品。每個取樣點取5~15個樣，將取好的土樣在滅菌牛皮紙上 混合，四分法獲取所需土壤的量。編號，記錄采集信息：每一采樣地的采集地點、采集日期、 采集深度等。
[0017] 將各采樣點混合土樣各稱取10g，放入盛有IOOmL無菌水(制備I: 10 土壤懸液)并 帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合并分散，此為原稀釋液；再 用ImL無菌吸管吸取ImL稀釋后的土壤溶液注入盛有9mL無菌水的試管中，用吸耳球多次 吹吸充分混勻，此為KT1稀釋懸液；依次類推將土樣梯度稀釋成10 _2,1〇_3,1〇_4,1〇_5,1〇_ 6的 土壤稀釋懸液，重復(fù)3次。多次吹吸混勻所制備好的稀釋液，取10'10'KT6三個梯度的稀 釋液，用無菌移液管吸?。ㄎ∏霸俅未滴_保稀釋液均勻）〇. 2mL加到已凝固的LB平板 上，然后用涂布棒迅速將菌液均勻涂開。待菌落長出，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落進入 平板劃線分離，劃線分離3次進行純化并進行革蘭氏染色鏡檢。
[0018] 上述LB平板就是由改良LB液體培養(yǎng)基加入瓊脂制備而成；所述改良LB液體培養(yǎng) 基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000mL，pH6.8，121°C滅菌 20min〇
[0019] 所述菌株dgnkzx004的培養(yǎng)方法，使用上述改良LB液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，具體 步驟如下： 51. 菌株的活化：將多粘類芽孢桿菌dgnkzX〇04的甘油菌種按體積比2%的接種量接種 到改良LB液體培養(yǎng)基中，32°C靜置活化培養(yǎng)20小時，得種子液； 52. 擴大培養(yǎng)：將種子液按體積比5%的接種量接種到改良LB液體培養(yǎng)基中，并于32°C 靜置培養(yǎng)20小時，得發(fā)酵液； 53. 菌體懸液制備：發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，離心獲得所需 的活菌體，最后用生理鹽水將菌體懸起制成細胞懸浮液。
[0020] 其中，S3 所述離心是 9500r/min、4°C離心 15min。
[0021] 本發(fā)明所述多粘類芽孢桿菌株dgnkzx004的菌落形態(tài)為圓形，奶油白色，表面干 燥不透明，凸起生長，濕潤，邊緣整齊，直徑1. 3~I. 7_ ;顯微鏡觀察菌體形態(tài)為革蘭式陽 性菌，桿狀。
[0022] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株的新應(yīng)用， 該菌株不僅對引起口紅花葉斑病的多主棒孢菌具有明顯、穩(wěn)定的抑菌效果，對口紅花葉斑 病具有良好的防治作用，而且還能夠促進口紅花的生長，對口紅花的栽培，主要是生物防治 及促生長方面具有顯著的應(yīng)用效果，能獲得很好的效果，尤其是對毛萼口紅花效果最為突 出，為口紅花等花卉的生物防治及促生長領(lǐng)域提供了一個新的微生物成員。
[0023] 本發(fā)明基于多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株，為花舟 的生物防治領(lǐng)域提供一種新的復(fù)合菌劑，以多粘類芽孢桿菌菌株dgnkzX〇04的菌體為有效 活性成分，配合甲殼素，實現(xiàn)了協(xié)同增效的目的，所述復(fù)合菌劑尤其是對口紅花的生物防治 及促生長具有良好的作用。
[0024] 上述復(fù)合菌劑是將甲殼素與多粘類芽孢桿菌dgnkzx004的菌體懸液相配伍，獲得 了顯著的口紅花生物防治及促生長效果，經(jīng)過不斷分析研究和大量實驗總結(jié)，在本發(fā)明提 供的合適的配伍構(gòu)成的體系下，菌株可以很好地成活并發(fā)揮活性作用，重要的是本發(fā)明菌 體懸液體系共同產(chǎn)生了顯著的應(yīng)用技術(shù)效果。
[0025] 本發(fā)明在獲得的多粘類芽孢桿菌/7〇/j?j^ra)dgnkzx004菌株的基 礎(chǔ)上，進一步總結(jié)得到各組分的合理配伍比例，在適宜的用量范圍內(nèi)，本發(fā)明的復(fù)合菌劑具 有很好的生物防治及促生長效果，應(yīng)用于口紅花，尤其是毛萼口紅花，接種多主棒孢菌后， 病情指數(shù)僅為23 (對照組病情指數(shù)為89);除此之外，本發(fā)明復(fù)合菌劑安全無毒、對土壤不 會產(chǎn)生任何副作用。
[0026] 本發(fā)明應(yīng)用所述菌株制備復(fù)合菌劑，并成功實現(xiàn)應(yīng)用，克服了通常微生物菌的活 性應(yīng)用局限于實驗室的缺陷，具有很好的實際應(yīng)用前景。所述復(fù)合菌劑制備方法簡單，應(yīng)用 方便，為微生物菌在花卉生物防治及促生長方面的應(yīng)用提供有力的技術(shù)啟示和指導(dǎo)，具有 重要的應(yīng)用價值和實際推廣應(yīng)用可行性。
【附圖說明】
[0027] 圖1為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004菌株菌落形態(tài)（LB培養(yǎng)基，32°C，2天)。
[0028] 圖2為多粘類芽孢桿菌dgnkzx004革蘭氏染色鏡檢結(jié)果。
[0029] 圖3為實施例2的葉斑病病情指數(shù)。
[0030] 圖4為實施例2的葉斑病防效。
[0031] 圖5為實施例3的枝條數(shù)量變化情況。
[0032] 圖6為實施例3的枝條節(jié)間生長變化情況。
【具體實施方