一種脫落細胞液基保存液、其用于制片的方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種脫落細胞液基保存液、其用于制片的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]結直腸癌是危害人類生命的常見惡性腫瘤，其發病率位居全球惡性腫瘤第三位。在我國其發病率與死亡率呈逐年上升趨勢。患者出現癥狀就診時往往已是晚期，療效差。如果能夠在早期發現并進行治療，則效果較好。目前應用于臨床的大腸癌檢測技術主要有:(I)糞便隱血檢測；(2)內窺鏡檢查；(3)糞便脫落細胞學檢測。其中，糞便脫落細胞學檢測由于其簡單易行、安全性強；對設備要求不高、費用低；對患者造成的痛苦少等特點，目前已經廣泛應用于臨床。
[0003]早在上世紀五十年代，就有糞便脫落細胞的檢測。由于糞便脫落細胞檢測方法費時費力，所以在很長一段時間內，都沒有建立起真正的檢測方法。薄層液基保存法已在宮頸刷片、痰、漿膜腔積液等標本的腫瘤細胞學診斷中得到了廣泛的應用，為臨床明確診斷提供了可靠的細胞系依據。但將液基薄層細胞系技術應用到提取糞便脫落細胞還比較少見。因為該方法需要首先用MEM復合營養液基提取細胞，再用硼酸對糞便中的粘液進行分解，然后用乙醇固定糞便中的脫落細胞。這樣繁瑣的步驟，不僅會影響檢測的最佳時機，還會導致檢測結果產生差異、準確性降低。此外由+于糞便中血紅細胞數量較少，采用原有的液基保存法，會導致糞便隱血的假陰性誤判。現在醫院臨床檢測中所用到的脫落細胞學檢測液基保存液，各個生產商品種繁多，該類商品主要功能有:(I)固定白細胞，上皮細胞和組織細胞；(2)溶解粘液蛋白防止包裹陽性細胞；(3)裂解紅細胞減少背景細胞。雖然這類產品能在普通脫落細胞學檢測中取得較好的效果，但是由于糞便中成分復雜，且含有較大量的食物殘渣和細菌及大量腸道粘液，所以普通的液基保存液不能很好地分離脫落細胞。同時普通的液基保存液，需要通過多個步驟對糞便脫落細胞進行處理，加大了糞便脫落細胞收集的難度。此外，糞便隱血是國際通用的結直腸癌篩查方法，是消化道惡性腫瘤早期診斷的重要篩查指標，但是目前還沒有結合糞便隱血和糞便脫落細胞檢測直腸癌的檢測方法。
【發明內容】
[0004]本發明克服了現有脫落細胞檢測液基保存液不能與糞便隱血結合檢測、多個步驟對糞便脫落細胞進行處理操作繁瑣、損傷血紅蛋白的缺陷，提供一種脫落細胞液基保存液，所述脫落細胞液基保存液可以固定脫落細胞，去除粘液蛋白，并且能夠保留血紅細胞以便觀察是否存在隱血癥狀。所述脫落細胞液基保存液結合了糞便隱血檢測和糞便脫落細胞檢測，可以應用于直腸癌的檢測中，并且所述脫落細胞液基保存液配制方便，操作簡便。
[0005]本發明提供一種脫落細胞液基保存液，所述脫落細胞液基保存液由以下成分組成:多聚甲醛3.8?4.2%、N-甲基-N-環己基-2-氨基-3，5-二溴苯甲胺鹽酸鹽0.8?1.5%、冰醋酸0.8?1.5%、乙酰半胱氨酸0.1?0.2%、氯化鈉0.75?0.85%、氯化鉀0.0l?0.03%、磷酸氫二鈉0.12?0.15%和磷酸二氫鉀0.025?0.03%，余量為水，使用PH調節劑調節pH至7.2?7.8，所述百分比為質量體積百分比。
[0006]本發明中，所述多聚甲醛為本領域常規的多聚甲醛；較佳地，為Sigmal58127。所述多聚甲醛為3.8?4.2% ;較佳的為4.0?4.1%，所述百分比為質量體積百分比。
[0007]本發明中，所述N-甲基-N-環己基-2-氨基-3，5-二溴苯甲胺鹽酸鹽為0.8?
1.5% ;較佳的為1.0?1.2%，所述百分比為質量體積百分比。
[0008]本發明中，所述乙酰半胱氨酸為0.1?0.2%;較佳的為0.12?0.15%，所述百分比為質量體積百分比。
[0009]本發明中，所述氯化鈉為0.75?0.85%;較佳的為0.80?0.82%，所述百分比為質量體積百分比。
[0010]本發明中，所述氯化鉀為0.01?0.03% ;較佳的為0.015?0.02%，所述百分比為質量體積百分比。
[0011]本發明中，所述磷酸氫二鈉為0.12?0.15%;較佳的為0.142?0.145%，所述百分比為質量體積百分比。
[0012]本發明中，所述磷酸二氫鉀為0.025?0.03% ;較佳的為0.27?0.28%，所述百分比為質量體積百分比。
[0013]本發明所述pH調節劑為本領域常規的pH調節劑；較佳地為氫氧化鈉。
[0014]較佳地，所述調節pH為調節pH至7.5。
[0015]本發明所述的水為本領域常規的水，較佳地為蒸餾水；更佳地為雙蒸水。
[0016]本發明所述的質量體積百分比表示組分在組合物中的濃度，是指每100毫升組合物中所含組分的克數。
[0017]本發明所述脫落細胞液基保存液的制備方法是，將一定質量的所述多聚甲醛、所述N-甲基-N-環己基-2-氨基-3，5- 二溴苯甲胺鹽酸鹽、所述冰醋酸、所述乙酰半胱氨酸、所述氯化鈉、所述氯化鉀、所述磷酸氫二鈉和所述磷酸二氫鉀溶解于所述水中，使用所述PH調節劑調節pH至7.2?7.8，然后加所述水定容至一定體積，即可。
[0018]本發明提供一種利用所述的脫落細胞液基保存液的液基薄層細胞學制片的方法，其包括以下的步驟:
[0019]I)將樣品放置于所述的脫落細胞液基保存液中3?8分鐘，得到混合液；
[0020]2)將步驟I)獲得的所述混合液依次通過篩目數為40目?200目且篩目數從小到大的篩網，除去雜質后得到濾液；
[0021]3)將步驟2)獲得的所述濾液5000?7000 rpm離心0.5?2分鐘，棄去上清，再加入所述脫落細胞液基保存液，混勻，得混勻的混合液；
[0022]4)將步驟3)獲得的所述混勻的混合液，使用液基薄層細胞涂片機進行制片。
[0023]本發明步驟I)為:將樣品放置于所述的脫落細胞液基保存液中3?8分鐘，得到混合液。其中，所述的方法的樣品的來源為本領域常規的來源；較佳地為糞便、宮頸刷片、痰液、尿液、漿膜腔積液；更佳地為糞便。步驟I)所述脫落細胞液基保存液的體積為本領域常規的體積；較佳地為8?15mL ;更佳地為10mL。所述放置于所述脫落細胞液基保存液的時間為本領域常規的時間，較佳地為5分鐘。
[0024]本發明步驟2)為:將步驟I)獲得的所述混合液依次通過篩目數為40目?200目且篩目數從小到大的篩網，除去雜質后得到濾液。其中，較佳地，步驟2)所述混合液依次通過40目、80目、100目和200目的篩網。
[0025]本發明步驟3)為:將步驟2)獲得的所述濾液5000?7000rpm離心0.5?2分鐘，棄去上清，再加入所述脫落細胞液基保存液，混勻，得混勻的混合液。其中，較佳地，步驟3)所述的離心的速度為6000rpm。較佳地，所述的離心的時間為I分鐘。所述脫落細胞液基保存液的體積為本領域常規的體積，較佳地為與步驟I)所述的脫落細胞液基保存液的體積相同的體積。
[0026]本發明步驟4)為:將步驟3)獲得的所述混勻的混合液，使用液基薄層細胞涂片機進行制片。其中，步驟4)所述混勻的混合液放置在本領域常規的容器中；較佳地，放置在液基保存瓶中；更佳地，所述的液基保存瓶購自湖南省麗拓生物科技有限公司。較佳地，所述的液基薄層細胞涂片機購自湖南省麗拓生物科技有限公司。所述的制片為本領域常規的制片，較佳地為TCT制片。
[0027]TCT是新柏氏液基細胞學檢測的簡稱。TCT采用液基薄層細胞檢測系統檢測宮頸細胞等多種組織細胞并進行細胞學分類診斷，它是目前國際上較先進的一種細胞學癌癥檢查技術。
[0028]本發明提供一種含有所述脫落細胞液基保存液的TCT法檢測脫落細胞的試劑盒。
[0029]較佳地，所述的試劑盒含有所述脫落細胞液基保存液。較佳的，所述的試劑盒還包括取樣桿、細胞分離膜杯和防脫載玻片。
[0030]在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
[0031]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0032]本發明的積極進步效果在于:(I)本發明采用多聚甲醛進行細胞固定。相對于醇類固定液，多聚甲醛對脫落細胞收縮小，較為溫和，適于較長期保存。(2)加入獨特的粘液分解劑，能把樣品中被粘液包裹的細胞成功分離出來，避免了陽性細胞堆積與丟失，從而能成功分離到脫落細胞。(3)能夠保留紅細胞，以便于觀察是否存在隱血癥狀(4)配制簡便，操作方便。
【附圖說明】
[0033]圖1為糞便脫落細胞保存液進行的正常人的糞便脫落細胞收集后的TCT制片，可見糞便中的單個有核細胞，以及一定數量的血紅細胞(如箭頭所示)；
[0034]圖2為糞便脫落細胞保存液進行的正常人的糞便脫落細胞收集后的TCT制片，可見糞便中的單個有核細胞；
[0035]圖3為糞便脫落細胞保存液進行的正常人的糞便脫落細胞收集后的TCT制片，可見糞便中的單個有核細胞，以及一定數量的血紅細胞(如箭頭所示)。
[0036]其中，圖1和圖3所對應的樣本為在正常人糞便樣品中加入少量正常人血液。
[0037]圖1?3的放大倍數均為200倍。
【具體實施方式】
[0038]下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0039]本發明所述的室溫為本領域常規的室溫，較佳地為10?30°C。
[0040]實施例1脫落細胞液基保存液的配制
[0041]按如下的配方組成配制脫落細胞液基保存液:
[0042]磷酸二氫鉀(KH2PO4):0.27g ；
[0043]磷酸氫二鈉(Na2HPO4):1.42g ；
[0044]氯化鈉(NaCl):8g ；
[0045]氯化鉀(KCl):0.2g ；
[0046]冰醋酸(HAc):10.49g ;
[0047]多聚甲醛:40g;
[0048]甲基-N-環己基-2-氨基-3，5- 二溴苯甲胺鹽酸鹽:10g ；
[0049]乙酰半胱氨酸:Ig
[0050]加雙蒸水后用NaOH調節pH至7.5定容至1L，即得所述的脫落細胞液基保