殺蟲蛋白的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種Cry2Ab蛋白質通過在植物中 表達來控制東方黏蟲為害植物的用途。
【背景技術】
[0002] 東方黏蟲（Mythimna seperata)屬鱗翅目夜蛾科，是一種主要以小麥、玉米、高粱、 大豆、水稻等糧食作物和牧草為危害對象的雜食性、迀移性、間歇暴發性害蟲，在我國除新 疆地區尚未報道發生外，其他各地均有危害。東方黏蟲喜食葉，三齡后能將整片葉咬食成缺 刻狀，或吃光心葉，形成無心苗。三齡后到達暴食期，能將幼苗地上部分全部吃光，或將整 個植株葉片吃掉只留下葉脈，造成嚴重減產，甚至絕收；東方黏蟲除喜食葉片外也可危害果 穗。
[0003] 玉米是中國重要的糧食作物，而近兩年東方黏蟲的危害呈暴發狀態，2012年二代 東方黏蟲危害玉米面積達到6495萬畝，2013年則危害玉米5800萬畝，嚴重影響到當地人口 的生存狀況。為了防治東方黏蟲，人們通常采用的主要防治方法有：農業防治、化學防治和 物理防治。
[0004] 農業防治是把整個農田生態系統多因素的綜合協調管理，調控作物、害蟲、環境因 素、創造一個有利于作物生長而不利于東方黏蟲發生的農田生態環境。如在成蟲產卵盛期 前選葉片完整、不霉爛的稻草8-10根扎成一小把，每畝30-50把，每隔5-7天更換一次（若 草把經用藥劑浸泡可減少換把次數），可顯著減少田間蟲口密度；還可在幼蟲發生期間放 鴨啄食。因農業防治必須服從作物布局和增產的要求，應用有一定的局限性，不能作為應急 措施，在東方黏蟲爆發時就顯得無能為力。
[0005] 化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是東方黏蟲綜合治理的重 要組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是東方黏蟲大發生的情況 下，是必不可少的應急措施。目前化學防治方法主要是藥液噴霧。但化學防治也有其局限 性，如使用不當往往會導致農作物發生藥害、害蟲產生抗藥性，以及殺傷天敵、污染環境，使 農田生態系統遭到破壞和農藥殘留對人、畜的安全構成威脅等不良后果。特別值得一提的 是，2012年東方黏蟲在東北地區大面積爆發，雖然政府投入了大量的人力、物力噴灑化學殺 蟲劑，但是仍然造成了無法挽回的蟲害減產，局部地區甚至絕收。
[0006] 物理防治主要根據害蟲對環境條件中各種物理因素的反應，利用各種物理因素如 光、電、色、溫濕度等以及機械設備進行誘殺、輻射不育等方法來防治害蟲。目前應用最廣 泛的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠距離用波，引誘害蟲 靠近，對東方黏蟲成蟲的防治具有一定的效果；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時清理高壓 電網上的污垢，否則會影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危 險；此外安裝燈的一次性投入較大。
[0007] 為了解決農業防治、化學防治和物理防治在實際應用中的局限性，科學家們經過 研宄發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物以防治植 物蟲害。Cry2Ab殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種 (Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，B.t. L )產生的不溶性伴抱結晶蛋白。
[0008] Cry2Ab蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性pH環 境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中 腸上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的 滲透壓變化及pH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。
[0009] 已證明轉Cry2Ab基因的植株可以抵抗玉米螟、棉鈴蟲等鱗翅目（Lepidoptera)害 蟲的侵害，然而，至今尚無關于通過產生表達Cry2Ab蛋白的轉基因植株來控制東方黏蟲對 植物危害的報道。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過產生表達Cry2Ab蛋 白的轉基因植株來控制東方黏蟲對植物危害的方法，且有效克服現有技術農業防治、化學 防治和物理防治等技術缺陷。
[0011] 為實現上述目的，本發明提供了一種控制東方黏蟲害蟲的方法，包括將東方黏蟲 害蟲至少與Cry2Ab蛋白接觸。
[0012] 進一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少產生所述Cry2Ab蛋白的宿主細胞中，所述 東方黏蟲害蟲通過攝食所述宿主細胞至少與所述Cry2Ab蛋白接觸。
[0013] 更進一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少產生所述Cry2Ab蛋白的細菌或轉基因 植物中，所述東方黏蟲害蟲通過攝食所述細菌或所述轉基因植物的組織至少與所述Cry2Ab 蛋白接觸，接觸后所述東方黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡，以實現對東方黏蟲危 害植物的控制。
[0014] 所述轉基因植物可以處于任意生育期。
[0015] 所述轉基因植物的組織為葉片、莖桿、果實、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0016] 所述對東方黏蟲危害植物的控制不因種植地點和/或種植時間的改變而改變。
[0017] 所述植物來自玉米、大豆、水稻、小麥、高粱、谷子、青稞或牧草。
[0018] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
[0019] 優選地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。所 述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
[0020] 在上述技術方案的基礎上，所述植物還可以包括至少一種不同于編碼所述Cry2Ab 蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
[0021] 進一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶 抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0022] 優選地，所述第二種核苷酸編碼CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
[0023] 進一步地，所述CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序 列。
[0024] 更進一步地，所述第二種核苷酸具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
[0025] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0026] 為實現上述目的，本發明還提供了一種Cry2Ab蛋白質控制東方黏蟲害蟲的用途。
[0027] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制東方黏蟲害蟲的植物的方法，包 括向所述植物的基因組中引入編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
[0028] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制東方黏蟲害蟲的植物種子的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，從而產生含有編碼Cry2Ab蛋白的 多核苷酸序列的種子。
[0029] 為實現上述目的，本發明還提供了一種培養控制東方黏蟲害蟲的植物的方法，包 括：
[0030] 種植至少一粒植物種子，所述植物種子的基因組中包括編碼Cry2Ab蛋白的多核 苷酸序列；
[0031] 使所述植物種子長成植株；
[0032] 使所述植株在人工接種東方黏蟲害蟲和/或東方黏蟲害蟲自然發生危害的條件 下生長，收獲與其他不具有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物 損傷和/或具有增加的植物產量的植株。
[0033] 本發明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞既可以是其體內表達 殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產生殺蟲蛋白的微生物。
[0034] 本發明術語"控制"和/或"防治"是指東方黏蟲害蟲至少與Cry2Ab蛋白接觸，接 觸后東方黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。進一步地，東方黏蟲害蟲通過攝食植物 組織至少與Cry2Ab蛋白接觸，接觸后全部或部分東方黏蟲害蟲生長受到抑制和/或導致死 亡。抑制是指亞致死，即尚未致死但能引起生長發育、行為、生理、生化和組織等方面的某種 效應，如生長發育緩慢和/或停止。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方法下培 養以用于產物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的控制東方 黏蟲害蟲的植物和/或植物種子，在人工接種東方黏蟲害蟲和/或東方黏蟲害蟲自然發生 危害的條件下，與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現包括但不限 于改善的莖桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產等。Cry2Ab蛋白對東方黏蟲的"控 制"和/或"防治"作用是可以獨立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"東方黏蟲害 蟲的物質的存在而減弱和/或消失。具體地，轉基因植物（含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷 酸序列）的任何組織同時和/或不同步地，存在和/或產生，Cry2Ab蛋白和/或可控制東方 黏蟲害蟲的另一種物質，則所述另一種物質的存在既不影響Cry2Ab蛋白對東方黏蟲的"控 制"和/或"防治"作用，也不能導致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所 述另一種物質實現，而與Cry2Ab蛋白無關。通常情況下，在大田，東方黏蟲害蟲攝食植物組 織的過程短暫且很難用肉眼觀察到，因此，在人工接種東方黏蟲害蟲和/或東方黏蟲害蟲 自然發生危害的條件下，如轉基因植物（含有編碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何組 織存在死亡的東方黏蟲害蟲、和/或在其上停留生長受到抑制的東方黏蟲害蟲、和/或與非 轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，即為實現了本發明的方法和/或用途，即 通過東方黏蟲害蟲至少與Cry2Ab蛋白接觸以實現控制東方黏蟲害蟲的方法和/或用途。
[0035] 在本發明中，Cry2Ab蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry 類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因 植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物 (第1親本）可以通過遺傳工程操作表達Cry2Ab蛋白質，第二種植物（第2親本）可以通 過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第1親本和第2親 本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0036] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此在本 發明中可以使用RNAi技術特異性剔除或關閉目標昆蟲害蟲中特定基因的表達。
[0037] 在分類系統上，一般主要根據成蟲翅的脈序、連鎖方式和觸角的類型等形態特征， 將鱗翅目分為亞目、總科、科等，而夜蛾科是鱗翅目中種類最豐富的科，全球已經發現了超 過2萬種夜蛾科昆蟲，其中絕大部分為農業害蟲；中國已報道夜蛾科昆蟲有2110種，分屬 18個亞科514個屬，其中在中國最常見的夜蛾科害蟲為為害棉花的棉鈴蟲和小地老虎、為 害水稻的大螟。盡管東方黏蟲與棉鈴蟲、小地老虎、大螟同屬于夜蛾科，除了在分類標準上 存在相似性，在其它形態結構上則存在極大差異；就好比植物中的草莓與蘋果一樣（同屬 于薔薇目薔薇科），它們都有花兩性，輻射對稱，花瓣5片等特征，但是其果實以及植株形態 卻是千差萬別。東方黏蟲不管是從幼蟲形態還是成蟲形態上來看，都具有其獨特的特征。 例如東方黏蟲具有迀飛的習性，每年3月至8月中旬隨氣流由南往北方向迀飛，8月下旬至 9月又隨偏北氣流向南迀移越冬；在北煒33度以北地區不能越冬。而同屬于夜蛾科的棉鈴 蟲即使是在東北地區，仍然可以越冬而無需迀飛至南方溫暖地區。
[0038] 同屬夜蛾科的昆蟲不僅在形態特征上存在較大的差異，同時在取食習性上也存在 差異。例如同為夜蛾科的棉鈴蟲，以鉆蛀型為害棉花的棉鈴或者玉米穗子，小地老虎為害玉 米等的莖基部，而東方黏蟲則更加偏好于為害葉片，大發生時往往是將葉片吃光，僅留下莖 桿與葉脈。取食習性的不同，也暗示著體內消化系統所產生的酶和受體蛋白不同。而消化道 中產生的酶是Bt基因起作用的關鍵點，只有能夠與特異性Bt蛋白相結合的酶或受體蛋白， 才有可能使得某個Bt基因對該害蟲具有抗蟲效果