一種酒瓶蘭組織培養快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種酒瓶蘭組織培養快速繁殖方法。
【背景技術】
[0002]酒瓶蘭(NolinarecurvataLem)為原產墨西哥西北部干燥炎熱地區、龍舌蘭科諾林那屬小喬木狀多肉草本植物。諾林那屬植物只有2-3種，在植物分類系統中地位較突出，因其繁殖相對困難，不易普及，故而被視為珍稀植物。酒瓶蘭莖干直立，下部肥大，形似酒瓶；葉片姿態婆娑，酷似幽蘭，故雅稱酒瓶蘭。由于它姿態嫵媚、奇特，喜陽又耐陰，大的植株除在植物園供展覽外，還可以布置在賓館及其他場所；小的植株配上造型合適的花盆，裝飾會議室、辦公室和居室，十分雅致，富有濃厚的熱帶氣息，呈現出一種奇特的異國情調，是一種特別適于熱帶地區綠化和美化的園林觀賞植物。此外，酒瓶蘭葉片中還含有大量留體皂苷，具有重要的天然藥物開發價值(Eskander等，2011)。但是，酒瓶蘭繁殖困難，制約了其市場需求與快速推廣。生長多年的植株有時會在莖基部自然萌生小芽(4齡以下者又無側枝)，可用于扦插繁殖，但繁殖系數低，并較難長成酒瓶狀莖干，所以，主要靠種子繁殖(黃獻勝，2001 ;鄧國富，2002)。但龍舌蘭科植物開花很晚，采收種子不易，國內栽培酒瓶蘭不易結籽，種子多由國外進口，價格昂貴；且酒瓶蘭需5齡左右才能開花，繁殖速度極慢(李意穎，1996 ;林云甲，2009 ;凌勇堅與姜寶東，2013)。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種酒瓶蘭組織培養快速地繁殖方法，它能夠有效快速地提高酒瓶蘭種苗繁殖速度和質量，實現酒瓶蘭優質種苗的工廠化育苗，滿足市場需求。
[0004]本發明通過以下技術方案達到上述目的:一種酒瓶蘭組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0005](I)外植體的選擇與消毒:取酒瓶蘭的種子作外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5分鐘，線狀自來水沖洗15?20分鐘，添加2?3滴吐溫-20的100mg/L0.1 %升汞消毒8?10分鐘，無菌水沖洗3?5次，最后用消毒濾紙去除表面水份，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0006](2)種子萌發獲得無菌試管苗:將步驟(I)獲得的外植體接種到MS發芽培養基中，在溫度為22?26度，光照強度15001ux，光照時間為8?10小時/天的條件下培養35天，種子發芽后獲得無菌試管苗，其中，MS發芽培養基為MS基本培養基中加入GA3赤霉素
0.1?0.5mg/L，30mg/L鹿糖，5mg/L瓊脂，培養基的pH為6.0 ;
[0007](3)試管苗叢生芽快速擴繁培養:將步驟(2)得到的無菌試管苗置于MS叢芽培養基中，在溫度為22?26度，光照強度15001UX，光照時間為8?10小時/天的條件下培養30天，獲得無菌試管苗叢生芽，其中，MS叢芽培養基為MS基本培養基中加入TDZ 0.1?
1.0mg/L，ΚΤ0.1 ?0.5mg/L，IΒΑ0.1 ?1.0mg/L，30mg/L 鹿糖，5mg/L 瓊脂，培養基的 pH 為6.0 ；
[0008](4)叢生芽壯苗培養:將步驟(3)得到的試管苗叢生芽置于MS壯苗培養基中，在溫度為22?26度，光照強度15001ux，光照時間為8?10小時/天的條件下培養30天，得到健壯植株，其中，MS壯苗培養基為MS基本培養基中加入6?BA 0.5?1.5mg/L，NAA0.1?0.5mg/L，30mg/L鹿糖，5mg/L瓊脂，培養基的pH為6.0 ;
[0009](5)健壯植株生根培養:將步驟⑷得到的健壯植株置于1/2MS生根培養基培養，在溫度為22?26度，光照強度15001ux，光照時間為8?10小時/天的條件下培養30天，得到帶根完整植株，其中，1/2MS生根培養基為MS基本培養基中加入0.1?1.0mg/LNAA，0.1?0.5mg/LABT生根粉，15g/L蔗糖，5g/L瓊脂，培養基pH為6.0 ;
[0010](6)煉苗與移栽:組培瓶中加入少量自來水，松開瓶蓋，煉苗一周，待表面角質形成后，將幼苗取出，洗凈根部培養基，立即移栽到沙床中，在沙床中生長一個月后移栽到大田。
[0011]本發明突出的優點在于:
[0012](I)對酒瓶蘭進行組織培養，快速獲得叢生芽，在短時間內培育出大量適合移栽的酒瓶蘭種苗，顯著提高了酒瓶蘭種苗的增殖系數和種苗質量，實現規模化生產，滿足市場上的需求。
[0013]在MS發芽誘導培養中，添加0.1?0.5mg/L GA3，可以打破酒瓶蘭種子休眠。
[0014]在MS繁殖培養基中添加的TDZ、KT和IBA屬于常見植物生長調節劑，比較便宜易得，可大大降低酒瓶蘭組織培養中的成本消耗，達到降低成本的目的。
[0015]在MS繁殖培養基中添加TDZ 0.1?1.0mg/L，KT 0.1?0.5mg/L可促進叢生芽分化，IΒΑ0.1?1.0mg/L，可促進叢生芽生長。
[0016]在MS壯苗培養基添加NAA 0.1?0.5mg/L，可促進叢生芽長高展葉。
[0017](2)在生根培養基中添加0.1?0.5mg/L ABT生根粉0.1?1.0mg/L NAA，可獲得帶根完整植株，這些完整植株經煉苗后可直接移栽于沙床。
[0018](3)采用本技術方案培養所得到的酒瓶蘭組培苗增殖系數達到20?30倍，獲得組培苗生根率在95%以上，移栽苗床成活率在90%以上，有效解決了酒瓶蘭工廠化育苗的問題。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明的技術方案進一步說明。
[0020]實施例1
[0021]本發明所述的酒瓶蘭組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0022](I)外植體的選擇與消毒:取酒瓶蘭的種子作外植體，依次用2%洗潔精水溶液浸泡5分鐘，線狀自來水沖洗15?20分鐘，添加2?3滴吐溫-20的100mg/L0.1 %升汞消毒8?10分鐘，無菌水沖洗3?5次，最后用消毒濾紙去除表面水份，得到外植體，其中無菌水為經高壓滅菌的蒸餾水；
[0023](2)種子萌發獲得無菌試管苗:將步驟(I)獲得的外植體接種到MS發芽培養基中，在溫度為22?26度，光照強度15001ux，光照時間為8?10小時/天的條件下培養35天，種子發芽后獲得無菌試管苗，其中，MS發芽培養基為MS基本培養基中加入GA3赤霉素0.5mg/L，30mg/L鹿糖，5mg/L瓊脂，培養基的pH為6.0 ;
[0024](3)試管苗叢生芽快速擴繁培養:將步驟(2)得到的無菌試管苗置于MS叢芽培養基中，在溫度為22?26度，光照強度15001UX，光照時間為8?10小時/天的條件下培養30天，獲得無菌試管苗叢生芽，其中，MS叢芽培養基為MS基本培養基中加入TDZ 1.0mg/L,KT 0.5mg/L，IBA 0.5mg/L，30mg/L 鹿糖，5mg/L 瓊脂，培養基的 pH 為 6.0 ;
[0025](4)叢生芽壯苗培養:將步驟(3)得到的試管苗叢生芽置于MS壯苗培養基中，在溫度為22?26度，光照強度15001ux，光照時間為8?10小時/天的條件下培養30天，得到健壯植株，其中，MS壯苗培養基為MS基本培養基中加入6?BA 1.0mg/L, NAA 0.3mg/L，30mg/L蔗糖，5mg/L瓊脂，培養基的pH為6.0 ;
[0026](5)健壯植株生根培養:將步驟⑷得到的健壯植株置于1/2MS生根培養基培養，在溫度為22?26度，光照強度15001ux，光照時間為8?10小時/天的條件下培養30天，得到帶根完整植株，其中，1/2MS生根培養基為MS基本培養基中加入1.0mg/L NAA, 0.5mg/LABT生根粉，15g/L蔗糖，5g/L瓊脂，培養基pH為6.0 ;
[0027](6)煉苗與移栽:組培瓶中加入少量自來水，松開瓶蓋，煉苗一周，待表面角質形成后，將幼苗取出，洗凈根部培養基，立即移栽到沙床中，在沙床中生長一個月后移栽到大田。
[0028]實施例2
[0029]本發明所述