一種鐵皮石斛種苗組織培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物生物技術領域，尤其涉及一種鐵皮石斛種苗組織培養的方法。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛是著名的石斛品種，具有獨特的藥用價值，位列中華九大仙草之首。秦漢時期的《神農本草經》記載鐵皮石斛“主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃”。現代化學和藥理研宄表明，鐵皮石斛的主要有效成分是多糖，多糖含量高達20-30%。因其所含的石斛多糖、生物堿、氨基酸、微量元素等成分具有增強機體的免疫能力，抗氧化，抗衰老，降低血糖，養陰生津，強腎益精，抑制腫瘤細胞，緩解體力疲勞等獨特功效。但是由于野生鐵皮石斛主要生長在崇山峻嶺的懸崖峭壁之上，因其種子極小，每個蒴果含有大約2000粒種子，細如粉塵且無胚乳，在自然條件下萌發率極低，自然資源十分稀少。加上常年無節制采掘，野生資源日漸枯竭，自然產量難以滿足目前市場需求。
[0003]迄今，鐵皮石斛的組織培養快速繁殖大多都選用莖尖、新芽、休眠芽為外植體，通過擬原球莖途徑培養。用無菌種子產生原球莖組培方法鮮有報道。盡管這些方法優化了傳統生產的培養基成分，操作簡便，生產成本低，藥用成分接近野生鐵皮石斛，但存在繁殖率較低，分化慢，難于進行批量生產和工廠化生產等問題。
【發明內容】
[0004]基于【背景技術】存在的技術問題，本發明提出了一種鐵皮石斛種苗組織培養的方法，在培養不同階段采用了不同配方的營養液，其均衡的營養成分不僅能促進石斛栽培苗的快速生長，且提高了石斛栽培苗的質量，而且不受季節限制，大大縮短了種苗組織培養的時間和成本，還能提高鐵皮石斛中多糖含量。
[0005]本發明提出的一種鐵皮石斛種苗組織培養的方法，包括如下步驟:
[0006]S1、滅菌:將接種室和接種器械進行滅菌；
[0007]S2、萌發:選取合格的鐵皮石斛的蒴果，對蒴果進行消毒處理，將消毒處理后的蒴果縱向切開，用鑷子取出種子均勻散于裝有萌發營養液的培養瓶中里進行種子萌發培養，培養35-40天后形成綠色的原球莖；
[0008]S3、移植:將原球莖移入裝有組培營養液的培養瓶中進行原球莖增殖分化培養，培養20-25天后得到幼苗；將幼苗移入裝有組培營養液的培養瓶中進行幼苗增殖分化培養，培養30-35天后得到苗高為Icm以上的小苗；將小苗移入裝有組培營養液的培養瓶中進行壯苗培養，培養60-65天后得到苗高為3-4cm的中苗；將中苗移入裝有組培營養液的培養瓶中進行壯苗培養，培養65-70天后得到苗高為5cm以上的鐵皮石斛種苗。
[0009]S2中合格的鐵皮石斛的蒴果為新鮮未裂開的鐵皮石斛蒴果。
[0010]優選地，SI中，所述滅菌為紫外滅菌和/或臭氧滅菌。
[0011]優選地，S2中，所述消毒處理為采用95%醫用酒精浸潤蒴果表面。
[0012]優選地，S2中，萌發營養液的組分包括:硫酸錳0.007-0.012g/L，硫酸鋅 6.2-6.4X 10_3g/L，硫酸銅 5.3-5.4X 10_5g/L，硫酸亞鐵 0.015-0.022g/L，硫酸鎂
0.15-0.24g/L，硝酸銨 0.77-0.83g/L，硝酸鉀 0.9-lg/L，氯化鈣 0.2-0.24g/L，氯化鈷 6.2-6.6X l(T5g/L，鉬酸鈉 4.2-4.3X l(T4g/L，磷酸二氫鈣 0.085-0.095g/L，碘化鉀 6.3-6.5 X 10 VL,硼酸 7.3-7.5X l(T3g/L，乙二胺四乙酸二鈉 0.03-0.05g/L，肌醇 0.12-0.15g/L，煙酸 3.1-3.4X l(T4g/L，鹽酸吡哆醇 6.4-6.5X l(T4g/L，鹽酸硫胺素
1.1-1.4X10_4g/L，甘氨酸 1.2-1.4X10_3g/L，瓊脂 4-4.2g/L，白糖 38_43g/L。
[0013]優選地，S2中，萌發營養液的組分包括:硫酸錳0.01g/L，硫酸鋅6.30X 10_3g/L，硫酸銅5.36X 10_5g/L，硫酸亞鐵0.02g/L，硫酸鎂0.19g/L，硝酸銨0.81g/L，硝酸鉀0.95g/L，氯化鈣 0.22g/L，氯化鈷 6.43X l(T5g/L，鉬酸鈉 4.29X l(T4g/L，磷酸二氫鈣 0.09g/L，碘化鉀6.39 X 10 VL,硼酸7.46X 10_3g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.04g/L，肌醇0.13g/L，煙酸3.21 X 10_4g/L，鹽酸吡哆醇 6.43 X 10_4g/L，鹽酸硫胺素 1.29 X 10_4g/L，甘氨酸 1.29 X 10_3g/L，瓊脂 4.09g/L，白糖 40g/Lo
[0014]優選地，S2中，種子萌發培養的培養條件如下:培養溫度為23_24°C，培養光照強度為1500-1800Lux，培養光照時間為12_13h/d，平均消毒頻率為1-1.5次/天。
[0015]優選地，S3中，組培營養液的組分包括:硫酸錳0.007-0.012g/L，硫酸鋅 6.2-6.4 X 10 Vl,硫酸銅 5.3-5.4X 10_5g/L，硫酸亞鐵 0.015-0.022g/L，硫酸鎂
0.15-0.24g/L，硝酸銨 0.77-0.83g/L，硝酸鉀 0.9-lg/L,氯化鈣 0.2-0.24g/L，氯化鈷 6.2-6.6X l(T5g/L，鉬酸鈉 4.2-4.3X l(T4g/L，磷酸二氫鈣 0.085-0.095g/L，碘化鉀 6.3-6.5 X 10 VL,硼酸 7.3-7.5X l(T3g/L，乙二胺四乙酸二鈉 0.03-0.05g/L，肌醇 0.12-0.15g/L，煙酸 3.1-3.4X l(T4g/L，鹽酸吡哆醇 6.4-6.5X l(T4g/L，鹽酸硫胺素
1.1-1.4X 10Vl,甘氨酸 1.2-1.4X 10_3g/L，瓊脂 4-4.2g/L，香蕉泥 67_72g/L，白糖38-43g/Lo
[0016]優選地，S3中，組培營養液的組分包括:硫酸錳0.01g/L，硫酸鋅6.30X 10_3g/L，硫酸銅5.36X 10_5g/L，硫酸亞鐵0.02g/L，硫酸鎂0.19g/L，硝酸銨0.81g/L，硝酸鉀0.95g/L，氯化鈣 0.22g/L，氯化鈷 6.43X l(T5g/L，鉬酸鈉 4.29X l(T4g/L，磷酸二氫鈣 0.09g/L，碘化鉀6.39 X 10 VL,硼酸7.46X 10_3g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.04g/L，肌醇0.13g/L，煙酸3.21 X 10_4g/L，鹽酸吡哆醇 6.43 X 10_4g/L，鹽酸硫胺素 1.29 X 10_4g/L，甘氨酸 1.29 X 10_3g/L，瓊脂 4.09g/L，香焦泥 70g/L，白糖 40g/L。
[0017]優選地，S3中，培養瓶中的移植密度為18-20株/瓶。
[0018]優選地，S3中，增殖分化培養和壯苗培養的培養條件如下:培養溫度為23_24°C，培養光照強度為1500-1800Lux，培養光照時間為12_13h/d，平均消毒頻率為1-1.5次/天。
[0019]上述的萌發營養液和組培營養液的溶劑均為蒸餾水。
[0020]本發明采用組織培養方法成苗，在培養不同階段采用了不同配方的營養液，其均衡的營養成分不僅能促進石斛栽培苗的快速生長，且提高了石斛栽培苗的質量；在原球莖誘導階段，萌發營養液能有效的提高了種子的誘導率，在原球莖分化階段，采用了組培營養液，使得增值系數提高到10，解決一直以來使用蒴果繁育時遇到的原球莖分化率低，增殖率低，試管苗長勢弱的問題；而且本發明不受季節限制，從鐵皮石斛種子到培養成種苗，只需7.5個月，大大縮短了種苗組織培養的時間和成本，與傳統種苗擴繁相比，種苗的擴繁速度得到大幅提高，種苗生長健壯、葉色濃綠，病蟲害少，易于管理，而且所得種苗在煉苗、移栽的過程中，成活率可達95%以上，產量能提高25%，與普通鐵皮石斛的有效成份含量相比，本發明所得的鐵皮石斛多糖含量高于普通鐵皮石斛，微量元素含量略高于或等于普通鐵皮石斛含量。
【具體實施方式】
[0021]下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0022]實施例1
[0023]本發明提出的一種鐵皮石斛種苗組織培養的方法，包括如下步驟:
[0024]S1、滅菌:將接種室和接種器械進行紫外滅菌；
[0025]S2、萌發:選取合格的鐵皮石斛的蒴果，對蒴果進行消毒處理，將95%醫用酒精浸潤蒴果表面，將消毒處理后的蒴果縱向切開，用鑷子取出種子均勻散于裝有萌發營養液的培養瓶中里進行種子萌發培養，培養溫度為23°C，培養光照強度為ISOOLux，培養光照時間為12h/d，平均消毒頻率為1.5次/天，培養35天后形成綠色的原球莖，其中萌發營養液的組分包括:硫酸錳0.012g/L，硫酸鋅6.2X 10_3g/L，硫酸銅5.4X 10_5g/L，硫酸亞鐵0.015g/L，硫酸鎂0.24g/L，硝酸銨0.77g/L，硝酸鉀lg/L，氯化鈣0.2g/L,氯化鈷6.6X 10_5g/L，鉬酸鈉 4.2 X l(T4g/L，磷酸二氫鈣 0.095g/L，碘化鉀 6.3 X l(T4g/L，硼酸 7.5 X l(T3g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.03g/L，肌醇0.15g/L，煙酸3.1 X 10_4g/L，鹽酸吡哆醇6.5 X 10_4g/L，鹽酸硫胺素 1.lX10_4g/L，甘氨酸 L4X10_3g/L，瓊脂 4g/L，白糖 43g/L ；
[0026]S3、移植:將原球莖移入裝有組培營養液的培養瓶中進行原球莖增殖分化培養，培養瓶中的移植密度為18株/瓶，培養25天后得到幼苗；將幼苗移入裝有組培營養液的培養瓶中進行幼苗增殖分化培養，培養瓶中的移植密度為18株/瓶，培養35天后得到苗高為Icm以上的小苗；將小苗移入裝有組培營養液的培養瓶中進行壯苗培養，培養瓶中的移植密度為18株/瓶，培養65天后得到苗高為3-4cm的中苗；將中苗移入裝有組培營養液的培養瓶中進行壯苗培養，培養瓶中的移植密度為18株/瓶，培養70天后得到苗高為5cm以上的鐵皮石斛種苗，其中增殖分化培養和壯苗培養的培養條件如下:培養溫度為23°C，培養光照強度為ISOOLux，培養光照時間為12h/d，平均消毒頻率為1.5次/天，組培營養液的組分包括:硫酸錳0.012g/L，硫酸鋅6.2X 10_3g/L，硫酸銅5.4X 10_5g/L，硫酸亞鐵0.015g/L，硫酸鎂0.24g/L，硝酸銨0.77g/L，硝酸鉀lg/L,氯化鈣0.2g/L,氯化鈷6.6X 10_5g/L，鉬酸鈉 4.2X l(T4g/L，磷酸二氫鈣 0.095g/L，碘化鉀 6.3X 10_4g/L，硼酸 7.5X l(T3g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.03g/L，肌醇0.15g/L，煙酸3.1 X 10_4g/L，鹽酸吡哆醇6.5 X 10_4g/L，鹽酸硫胺素
1.lX10_4g/L，甘氨酸 L4X10_3g/L，瓊脂 4g/L，香蕉泥 67g/L，白糖 43g/L。
[0027]實施例2
[0028]本發明提出的一種鐵皮石斛種苗組織培養的方法，包括如下步驟:
[0029]S1、滅菌:將接種室和接種器械進行臭氧滅菌；
[0030]S2、萌發:選取合格的鐵皮石斛的蒴果，對蒴果進行消毒處理，將95%醫用酒精浸潤蒴果表面，將消毒處理后的蒴果縱向切開，用鑷子取出種子均勻散于裝有萌發營養液的培養瓶中里進行種子萌發培養，培養溫度為24°C，培養光照強度為1500Lux，培養光照時間為13h/d，平均消毒頻率為I次/天，培養40天后形成綠色的原球莖，其中萌發營養液的組分包括:硫酸錳0.007g/L，硫酸鋅6.4X l(T3g/L，硫酸銅5.3 X l(T5g/L，硫酸亞鐵0.022g/L，硫酸鎂0.15g/L，硝酸銨0.83g/L，硝酸鉀0.9g/L，氯化鈣0.24g/L，氯化鈷6.2 X 10_5g/L，鉬酸鈉 4.3 X l(T4