一種多倍體羅漢果植株的培育方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物遺傳育種領域，具體涉及一種多倍體羅漢果植株的培育方法。
【背景技術】
[0002]羅漢果是衛生部首批公布的藥食兩用名貴中藥材，果實營養價值很高，含豐富的維生素C以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白質、脂類等，羅漢果甜苷是一種低熱量高甜度的天然甜味劑，其甜度堪稱世界之最，且低熱、無毒，可為糖尿病和肥胖病患者等食用。羅漢果甘、酸、性涼，具有清熱涼血、生津止咳、滑腸排毒、嫩膚益顏、潤肺化痰等功效，是廣西著名的道地藥材。廣西羅漢果產量占世界的90%以上，成為桂北重要的特色產業，已獲國家地理標志廣品保護。
[0003]羅漢果種子數量多、所占比率大，幾乎不含甜苷，但影響貯運、加工、風味和品質；人工剝除種子，成本高，得不償失。無籽果實通常果皮厚、硬度強，利于運輸、貯藏、保鮮和加工，有較高的果實利用率和提取得率，能降低生產成本，無后苦味，品質好。培育無籽羅漢果新品種是實現羅漢果果實無籽化最經濟和有效的措施。因此，如何去除種子長期以來是羅漢果開發利用中需要解決的重大問題。
[0004]多倍體具有器官巨大性、果實少籽或無籽、抗逆性強、產量高、品質優等諸多優點。多倍體種質資源創新是育種的重要目標之一。近年來，我國越來越多的企業加入到生產羅漢果的行列，組織培養是羅漢果產業化發展的重要手段。但目前羅漢果研宄中采用秋水仙堿滴于田間植株芽尖的染色體加倍方法，誘變效率和植株成活率非常低。因此，如何快速有效地獲得多倍體羅漢果品種是急需要解決的技術難題。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種多倍體羅漢果植株的培育方法，利用優化的包含植物生長調節劑TDZ和赤霉素的MS誘導液體培養基誘導雌/雄株的葉片或者莖部快速產生大量叢芽，振蕩培養，將加倍處理后的叢芽芽尖切下進行轉接培養、生根培養，根據組培苗形態表現，結合根尖染色體的鑒定，用于確定誘導獲得的多倍體羅漢果的染色體數目，進一步純化培養和擴大培養，可以快速獲得大量多倍體羅漢果植株。
[0006]本發明提供的技術方案為:
[0007]一種多倍體羅漢果植株的培育方法，應用MS誘導液體培養基振蕩培養羅漢果雌/雄株的葉片或者莖部，獲得羅漢果叢芽，以用于制備多倍體羅漢果植株，其中，在培養之前，需要將羅漢果雌/雄株的葉片或者莖部進行表皮細胞劃傷處理。
[0008]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，所述MS誘導液體培養基中添加有植物生長調節劑TDZ、赤霉素和秋水仙堿。
[0009]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，所述MS誘導培養中，所述植物生長調節劑TDZ、所述赤霉素和秋水仙堿的添加量分別為:0.5?1.5mg/L、l.2?2.2mg/L和 0.8 ?1.5g/Lo
[0010]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，所述植物生長調節劑TDZ和所述赤霉素的添加量分別為:1.2mg/L、l.5mg/L和1.0g/L。
[0011]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，所述MS誘導液體培養基中還包括:0.2?1.0mg/L吲哚丁酸和15?30g/L蔗糖，并調節初始pH值為5.5?5.8。
[0012]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，所述莖部包括帶有腋芽的莖段和莖尖。
[0013]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，將羅漢果雌/雄株的葉片或者莖部在MS誘導液體培養基中培養的條件為:溫度為24?26°C、光照強度為1500?20001ux、光照時間為12?16h/d和15?23天，誘導產生大量叢芽。
[0014]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，還包括轉接培養、生根培養、純化培養和擴大培養；
[0015]在所述誘導培養之后進行所述轉接培養，所述轉接培養在MS轉接液體培養基中進行，將經過所述誘導培養得到的叢芽在溫度為22?26°C，光照強度為1500?20001ux，及光照時間為12?16h/d的條件下培養28?35天，以產生苗形態變異，得到幼芽；
[0016]所述MS轉接液體培養基包含:MS，0.08?0.3mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.05?0.15mg/L吲哚乙酸和15?30g/L蔗糖，并調節初始pH值為5.5?5.8 ;
[0017]在所述轉接培養之后進行所述生根培養，所述生根培養在MS生根培養基中進行，將經過所述轉接培養得到的幼芽在溫度為22?26°C，光照強度為1500?20001ux，及光照時間為12?16h/d的條件下繼代2?3次，得到多倍體；
[0018]所述MS生根培養基包含:MS，0.05?0.15mg/L萘乙酸，8?20g/L蔗糖和4?5g/L瓊脂，并調節初始pH值為5.5?5.8 ;
[0019]在所述生根培養之后進行所述純化培養，所述純化培養在MS純化培養基中進行，將經過所述生根培養得到的多倍體在溫度為22?26°C，光照強度為1500?20001ux，及光照時間為12?16h/d的條件下純化2?3代，得到多倍體苗；
[0020]所述MS純化培養基包含:MS，0.08?0.3mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.05?0.15mg/L萘乙酸，15?30g/L蔗糖和4?5g/L瓊脂，并調節初始pH值為5.5?5.8 ;
[0021]在所述純化培養之后進行所述擴大培養，所述擴大培養在MS擴大培養基中進行，將經過所述純化培養得到的多倍體苗在溫度為22?26°C，光照強度為1500?20001ux，及光照時間為12?16h/d的條件下擴繁培養下28?35天，得到大量染色體加倍的羅漢果種質；
[0022]所述MS擴大培養基包含:MS，0.4?0.6mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.1?0.3mg/L吲哚丁酸，15?30g/L蔗糖和4?5g/L瓊脂，并調節初始pH值為5.5?5.8。
[0023]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，所述轉接培養在MS轉接液體培養基中進行，將經過所述誘導培養得到的叢芽在溫度為24°C，光照強度為15001uX，及光照時間為15h/d的條件下培養30天，以產生苗形態變異，得到幼芽；
[0024]所述MS轉接液體培養基包含:MS，0.2mg/L 6_芐基腺嘌呤，0.lmg/L吲哚乙酸和30g/L蔗糖，并調節初始pH值為5.8 ；
[0025]所述生根培養在MS生根培養基中進行，將經過所述轉接培養得到的幼芽在溫度為24°C，光照強度為15001uX，及光照時間為15h/d的條件下繼代2?3次，得到多倍體；
[0026]所述MS生根培養基包含:MS，0.lmg/L萘乙酸，15g/L蔗糖和5g/L瓊脂，并調節初始PH值為5.8 ；
[0027]所述純化培養在MS純化培養基中進行，將經過所述生根培養得到的多倍體在溫度為24°C，光照強度為15001uX，及光照時間為15h/d的條件下純化2?3代，得到多倍體苗；
[0028]所述MS純化培養基包含:MS，0.2mg/L 6_芐基腺嘌呤，0.lmg/L萘乙酸，30g/L蔗糖和5g/L瓊脂，并調節初始pH值為5.8 ；
[0029]所述擴大培養在MS擴大液體培養基中進行，將經過所述純化培養得到的多倍體苗在溫度為24°C，光照強度為15001UX，及光照時間為15h/d的條件下擴繁培養下30天，得到大量染色體加倍的羅漢果種質；
[0030]所述MS擴大培養基包含:MS，0.5mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.2mg/L吲哚丁酸，30mg/L蔗糖和5g/L瓊脂，并調節初始pH值為5.8。
[0031]優選的是，所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，在所述純化培養之前還包括染色體倍性鑒定。
[0032]本發明的有益效果是:
[0033]第一、選擇羅漢果雌/雄株葉片或者莖部為培養部位，出芽多且快，具有好的培養效果，克服了基于未授粉子房、幼胚、種子(苗)等加倍處理所得后代還要進行性別鑒定、育種周期長等的不足；
[0034]第二、誘導培養采用MS誘導液體培養基，轉接培養采用MS轉換液體培養基，均為液體培養基，與葉片接觸面積更大，使葉片吸收更多的營養物質，使營養成分的分布比較均勻，更容易得到多倍體，獲得好的培養效果；
[0035]第三、MS誘導液體培養基加入了植物生長調節劑TDZ、赤霉素，TDZ是一種新型作用力很強的植物生長調節劑，具有很強的細胞分裂素活性，可以促進組織萌發和生長，赤霉素促進葉片或者莖部的生長，提高結實率，其中，0.5?1.5mg/L TDZ和1.2?2.2mg/L赤霉素具有顯著的快速叢芽生成效果；
[0036]第四、MS誘導液體培養基加入了秋水仙堿，較之傳統多倍體育種中利用秋水仙堿滴于田間植株芽尖的處理方法，降低了死亡比率并提高了染色體加倍的效率，由于秋水仙堿有劇毒，故選擇0.8?1.5g/L秋水仙堿，兼具好的細胞分裂抑制效果；
[0037]第五、MS轉換液體培養基添加細胞分裂素6-芐基腺嘌呤和生長素吲哚乙酸培養具有好的苗形態的幼芽，MS生根培養基添加生長素萘乙酸獲得完整的帶根苗，切成帶腋芽的莖段，MS純化培養基添加細胞分裂素6-芐基腺嘌呤和生長素萘乙酸純化2?3代獲得多倍體苗，MS擴大培養基添加細胞分裂素6-芐基腺嘌呤和生長促進劑吲哚丁酸，獲得大量無嵌合體多倍體羅漢果雌/雄植株；
[0038]第六、MS誘導液體培養基誘導培養后，每片葉片可獲得20?30個芽，MS轉換液體培養基轉接培養后，叢芽團有60%的芽符合形態學鑒定，多倍體苗生根后成活率達90%。
[0039]本發明所述的多倍體羅漢果植株的培育方法，能夠快速、高效獲得具有優良母性遺傳性狀的多倍體羅漢果植株，成本低、效率高、品種好，實現羅漢果雌/雄株染色體加倍，獲得的多倍體羅漢果植株多為制備四倍體，其與二倍體羅漢果雄/雌株雜交獲得三