一種茄子花藥培養誘導單倍體植株的培養基及其方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物生物技術領域的一種茄子花藥培養誘導單倍體植株的培養基及其方法。
【背景技術】
[0002]植物花藥培養技術在作物遺傳育種理論和實踐研究中具有廣闊的應用前景，通過花藥培養可快速有效的獲得純合雙單倍體，避免了通過傳統育種手段需要多代自交才可以獲得純合穩定的品系，從而大大縮短了育種周期，提高了選擇效率，降低成本。此外，通過花藥培養獲得的雙單倍體可直接用于遺傳圖譜的構建、培育新品種或作為優良親本用于品種改良。利用花藥培養誘導單倍體或雙單倍體已在很多植物上有成功的報道，同時利用獲得的新種質資源已進行了新品種的選育和推廣，并取得了良好的社會和經濟效益。
[0003]隨著植物花藥培養技術的發展，為茄子新品種的選育開辟了一條新途徑。利用茄子花藥可快速獲得純系和突變體，創新種質資源，對茄子的品種改良具有重要的意義。目前茄子花藥培養在實際育種中的應用的不足有愈傷組織誘導率較低，再生植株分化率低，單倍體植株的加倍率低，培養周期長等。因此，如何提高茄子花藥培養中愈傷組織的誘導率和愈傷組織分化植株的分化率及單倍體植株的加倍率是茄子花藥培養技術研究中急需解決的一個難題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有花藥培養技術中愈傷組織誘導率低的不足，愈傷組織分化植株分化率低的不足及單倍體植株加倍率低的不足，給出一種茄子花藥培養誘導單倍體植株的培養基及其方法，通過這種方法可快速誘導茄子花藥形成愈傷組織，提高愈傷組織的誘導分化率和單倍體植株的加倍率，從而豐富適宜的茄子花藥培養條件，為建立高效的茄子花藥培養植株再生體系奠定基礎。
[0005]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
一種茄子花藥培養誘導單倍體植株的培養基，其特征在于:所述培養基包括茄子花藥培養愈傷組織誘導培養基和愈傷組織分化培養基，所述茄子花藥培養愈傷組織誘導培養基為:MS 基本培養基，0.2-0.5mg/L 2，4-D，0.5-lmg/L KT, 5-lOmg/L Vc, 3% 蔗糖，5g/L 瓊脂，PH值5.8 ;所述愈傷組織分化培養基為:MS基本培養基，0.01-0.05mg/L IAA, 1.0-2.0mg/L6-BA，0.1-0.5g/L 活性炭，2% 蔗糖，5.5g/L 瓊脂，PH 值 5.8。
[0006]所述茄子花藥培養愈傷組織誘導培養基為:MS基本培養基，0.2mg/L 2，4-D，0.9mg/L KT, I Omg/L Vc, 3%蔗糖，5g/L瓊脂，PH值5.8 ;所述愈傷組織分化培養基為:MS基本培養基，0.02mg/L IAA, 2.0mg/L 6-BA, 0.5g/L 活性炭，2% 蔗糖，5.5g/L 瓊脂，PH 值 5.8。
[0007]所述茄子花藥的培養包括如下步驟:
O從爺子植株上生長對爺或四門斗爺的位置上選取花蕾，花蕾中花藥細胞處于單核中期至單核靠邊期，花蕾直徑7-10mm，花藥為黃綠色偏綠； 2)預處理:將采集回來的花蕾用防水袋或培養瓶封閉，置于4-5°C冷藏室保存12-24
h ；
3)滅菌:先用70%或者75%的酒精進行花蕾表面消毒30s，再用次氯酸鈉原液的體積濃度為7%溶液浸泡15-20min，其中次氯酸鈉原液中次氯酸鈉的質量濃度為10%，之后用無菌水洗滌3-4次，每次3min，然后用無菌紙吸干花蕾備用；
4)接種:在無菌工作臺上從滅完菌的花蕾中輕輕剝取花藥，接種于裝有茄子花藥培養愈傷組織誘導培養基的Φ 60mm培養皿中，每個培養皿裝有1mL培養基，每個培養皿接1_2個花蕾的花藥；
5)熱激處理:將接種好花藥的培養皿放到培養箱內進行熱激處理，黑暗培養，熱激溫度為35?40°C，處理4?9d ；
6)花藥培養:經高溫熱激處理后的花藥，放置在25-28°C，光照強度1500-2000LX、光照12-16h/d下培養，每隔15-20 d轉接次，30-40d出現愈傷組織；
7)愈傷組織再生植株:當花藥中部或頂部愈傷組織塊長到直徑約10_，將愈傷組織轉接到愈傷組織分化培養基上，每隔15-20 d切割繼代一次，30-35 d愈傷組織上開始分化出綠色芽點，繼代培養條件:光照強度1500-2000LX、光照12-16h/d，溫度為25_28°C，經過繼代培養，45%-55%的愈傷組織分化為成熟的胚狀體直接生成根莖葉具全的完整小植株；
8)再生植株誘導生根:8%-12%的愈傷組織直接分化出無根的再生芽，當芽苗長到2-3cm時，切下帶部分愈傷組織的小苗，轉接到MS培養基中，在光照強度1500-2000LX、光照12-16h/d，溫度為25-28°C生根培養條件下，10_15d后長出不定根，生成完整植株，生根率為 90% ；
9)倍性檢測:采用根尖生長點染色體倍數檢測方法，在無菌工作臺中從培養瓶中剪取生根再生苗的幼嫩根尖進行檢測；
10)單倍體植株加倍:將步驟9檢測所得單倍體植株采用生長點浸泡法，移栽后在傍晚剝去單倍體植株的生長點外部幼葉，使生長錐外漏，用脫脂棉蘸取0.3-1.0%秋水仙堿+1.5%DMSO溶液包裹生長錐，外邊再用黑色塑料膜包裹，處理f3h，可得二倍體正常茄子雌雄花，加倍率達60%，此方法能在茄子生長的不同時期進行，打破了秋水仙素加倍處理只能在苗期進行的局限。
[0008]所述步驟(5)中，將接種好花藥的培養皿放到培養箱內進行熱激處理，黑暗培養，熱激溫度為36 °C，處理5 d。
[0009]所述步驟(10)中，用脫脂棉蘸取0.5 %秋水仙堿+1.5%DMS0溶液包裹生長錐，夕卜邊再用黑色塑料膜包裹。
[0010]與現有技術相比，本發明在基本培養基中添加適量的VC和活性炭及使用IAA，具有愈傷組織的誘導率高，愈傷組織分化效率高，培養效果好，不易褐化等優點，愈傷組織培養時間長，可繼代培養2年，從培養的愈傷組織中不斷誘導再生植株。愈傷組織的誘導率最高可達90%，植株再生率最高達到47%，單倍體率可達60%，適宜濃度和方法的秋水仙素處理使單倍體的加倍率高達60%;將本發明花藥培養方法應用于茄子遺傳育種中，可以大大提高茄子花藥培養再生植株的誘導率，豐富茄子優良基因型個體，完善茄子單倍體育種途徑，縮短育種周期，為加快茄子遺傳育種和茄科植物花藥離體培養研究提供技術和理論依據。
【附圖說明】
[0011]圖1是本發明的一個實施例剛接種的花藥示意圖圖2是本發明的一個實施例膨大的花藥示意圖
圖3是本發明的一個實施例產生愈傷組織的花藥示意圖圖4是本發明的一個實施例愈傷組織分化出茄子芽苗的示意圖圖5是本發明的一個實施例根葉芽俱全的再生植株示意圖圖6是本發明的一個實施例再生苗移栽示意圖圖7是本發明的一個實施例秋水仙素誘導示意圖。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:一種茄子花藥培養誘導單倍體植株的培養基及其方法，其步驟如下:
O從爺子植株上生長對爺或四門斗爺的位置上選取花蕾，花蕾中花藥細胞處于單核中期至單核靠邊期，花蕾直徑10mm，花藥為黃綠色偏綠；
2)預處理:將采集回來的花蕾用防水袋或培養瓶封閉，置于4-5°C冷藏室保存24h ；
3)滅菌:先用75%的酒精進行花蕾表面消毒30s，再用質量濃度為7%次氯酸鈉原液溶液浸泡20min，其中次氯酸鈉原液中次氯酸鈉的質量濃度為10%，之后用無菌水洗滌4次，每次3min，然后用無菌紙吸干花蕾備用；
4)接種:在無菌工作臺上從滅完菌的花蕾中輕輕剝取花藥，接種于裝有茄子花藥培養愈傷組織的誘導培養基的Φ60πιπι培養皿中，每個培養皿裝有1mL培養基，每個培養皿接1-2個花蕾的花藥；
5)熱激處理:將接種好花藥的培養皿放到培養箱內進行熱激處理，黑暗培養，熱激溫度為36°C，處理5d;
6)花藥培養:經高溫熱激處理后的花藥，放置在25-28°C，光照強度1500-2000LX、光照12-16h/d下培養，視培養基情況，每隔20d轉接培養基一次，35d左右會出現愈傷組織；
7)愈傷組織再生植株:當花藥中部或頂部愈傷組織塊長到直徑約10_，將愈傷組織轉化到愈傷組織分化培養基上，每間隔15-20 d切割繼代一次，30-40 d愈傷組織上開始分化出綠色芽點，繼代培養條件:光照強度1500-2000LX、光照12-16h/d，溫度為25_28°C，經過繼代培養，50%左右的愈傷組織分化為成熟的胚狀體直接生成根莖葉具全的完整小植株；
8)再生植株誘導生根:10%左右的愈傷組織直接分化出無根的再生芽，當芽苗長到3cm時，切下帶部分愈傷組織的小苗，轉接到MS培養基中，在光照強度1500-2000LX、光照12-16h/d，溫度為25-28°C生根培養條件下，15d后，有不定根出現；
9)倍性檢測:采用根尖生長點染色體倍數檢測方法，在無菌工作臺中從培養瓶中剪取生根再生苗的幼嫩根尖進行檢測；
10)單倍體植株加倍:將步驟9檢測所得單倍體植株采用生長點浸泡法加倍，移栽后在傍晚剝去單倍體植株的生長點外部幼葉，使生長錐外漏，用脫脂棉蘸取0.5%秋水仙堿+1.5%DMS0溶液，包裹生長錐，外邊再用黑色塑料膜包裹，處理2h，可得二倍體正常茄子雌雄花，加倍率達60%。
[0013]所用培養基:
愈傷組織誘導培養基的主要成分為MS基本培養基，2，4-D，KT, Vc，蔗糖和瓊脂，其中2，4-D的濃度為0.2mg/L, KT的濃度為0.9mg/L, Vc的濃度為10mg/L,鹿糖的濃度為3%,瓊脂的濃度為5g/L，pH值為5.8;
愈傷組織分化培養基的主要成分為:MS基本培養基，IAA，6-BA，活性炭，蔗糖，瓊脂，其中IAA的濃度為0.02mg/L, 6-BA的濃度為2.0mg/L,活性炭的濃度為0.5g/L，蔗糖的濃度為2%，瓊脂的濃度為5.5g/L，pH值為5.8。
[0014]實施例2:—種茄子花藥培養誘導單倍體植株的培養基及其方法，其步驟如下:
O從爺子植株上生長對爺或四門斗爺的位置上選取花蕾，花蕾中花藥細胞處于單核中期至單核靠邊期，花蕾直徑10mm，花藥為黃綠色偏綠；
2)預處理:將采集回來的花蕾用防水袋或培養瓶封閉，置于4-5°C冷藏室保存24h ；
3)滅菌:先用75%的酒精進行花蕾表面消毒30s，再用質量濃度為7%次氯酸鈉原液溶液浸泡20min，其中次氯酸鈉原液中次氯酸鈉的質量濃度為10%，之后用無菌水洗滌4次，每次3min，然后用無菌紙吸干花蕾備用；
4)接種:在無菌工作臺上從滅完菌的花蕾中輕輕剝取花藥，接種于裝有茄子花藥培養愈傷組織的誘導培養基的Φ60πι