一種黃瓜大孢子培養中克服再生植株花打頂的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物組織培養領域，特別涉及一種在黃瓜大孢子培養過程中，克服胚 狀體分化成再生植株后發生花打頂的方法。
【背景技術】
[0002] 黃瓜大孢子培養通過誘導黃瓜大孢子出胚，可以快速產生純合的育種新材料（純 系），縮短了育種年限，提高育種效率，還可用作遺傳轉化的優良受體材料。通過黃瓜大孢子 培養成功獲得的胚狀體，要轉移到再生培養基中進行植株的再生，而在植株再生過程中由 于培養基的成份和外界培養環境條件等因素，會導致很大比例的再生小植株發生花打頂的 生理障礙（小植株在再生培養基上持續大量開花直至養分耗盡最后凋亡），使得再生小植 株不能成功的發育成健康的植株，花打頂現象嚴重影響黃瓜大孢子培養的植株再生率。
[0003] 因此，在黃瓜大孢子培養的科研和實踐中，需要找到一種有效地克服再生植株發 生花打頂生理障礙的培養方法。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種黃瓜大孢子培養中克服再生植株花打頂的方法，該方法通過將發 生花打頂的再生植株移至恢復培養基進行恢復培養，并控制所述恢復培養的光照條件、溫 度條件、濕度條件，將所述發生花打頂的再生植株恢復為正常再生植株。
[0005] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0006] -種黃瓜大孢子培養中克服再生植株花打頂的方法，通過將發生花打頂現象的再 生植株移至恢復培養基進行恢復培養，并控制所述恢復培養的光照條件、溫度條件、濕度條 件，將所述發生花打頂的再生植株恢復為正常再生植株；
[0007] 進一步地，所述恢復培養基為，以MS基本培養基為基礎，添加赤霉素0. 3-1.Omg/ L，優選為0? 5mg/L;
[0008] 進一步地，所述光照條件為：白天光照強為度6000LUX-12000LUX，優選為 9000LUX，光照時間12-18h，優選為16h ;夜晚光照強度為0LUX，光照時間為6h-12h，優選為 8h ；
[0009] 進一步地，所述溫度條件為：白天溫度為25_30°C，優選溫度28°C;夜晚溫度為 18-25 °C，優選為 20 °C ;
[0010] 進一步地，所述濕度條件為：白天空氣濕度為30% -70 %，優選為50% ;夜晚空氣 為60% -90%，優選為85%。
[0011] 進一步地，所述黃瓜的品種為北京102、中農26、津優1中的一種或幾種。
[0012] 相比現有技術，本發明具有如下有益效果：
[0013] 1、本發明通過添加有赤霉素（GA)的恢復培養基，與光照條件、溫度條件、濕度條 件協同作用，可以使發生花打頂的小植株打破花打頂生理障礙，培養30天后花打頂植株轉 化為正常植株的比率達到20-70. 3%，大大提供黃瓜大孢子培養的植株再生率。
[0014] 2、本發明操作簡便易行，成本低廉，適合在黃瓜大孢子培養中廣泛推廣使用，克服 花打頂生理障礙。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例2中發生花打頂生理障礙的再生植株的照片。
[0016] 圖2為實施例2中培養30天后花打頂植株轉化為健康植株的照片。
【具體實施方式】
[0017] 本發明提供一種黃瓜大孢子培養中克服再生植株花打頂的方法，該方法通過將發 生花打頂的再生植株移至恢復培養基進行恢復培養，并控制所述恢復培養的光照條件、溫 度條件、濕度條件，將所述發生花打頂的再生植株恢復為正常再生植株。
[0018] 該方法包括如下步驟：
[0019] 步驟一、更換培養基：在無菌條件下，將發生花打頂的再生植株移至恢復培養基， 得到更換完培養基的再生植株。
[0020] 上述發生花打頂的再生植株是通過以下方法獲得的：
[0021] 取品種為北京102、或中農26、或津優1的黃瓜植株上開花前Id的子房作為外 植體；將該外植體清洗后，在超凈工作臺上用75%的乙醇溶液表面消毒30s，再用2. 5%的 NAC10溶液滅菌15min，再用無菌水清洗3-4遍，每次lmin;再將子房橫切為1mm厚度的切 片，先接種到誘導培養基（MS+3%蔗糖+1%瓊脂+0.04mg/L TDZ)，進行35°C熱激處理，時 間為2d;完成熱激處理5-7d后，可觀察到子房薄片上有球型胚狀物的突起，將該子房薄片 轉移到分化培養基（MS+3%蔗糖+1%瓊脂+0. 2mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA)，室溫下進行胚的 分化和發育，得到發育成熟的胚狀體；將該發育成熟的胚狀體轉移到再生培養基（MS+3% 蔗糖+0. 8%瓊脂，或MS+3%蔗糖+0. 8%瓊脂+0. 05-0. lmg/L 6-BA)上進行植株再生培養， 得到再生植株，該再生培養的環境為：白天光強3000LUX左右，16小時光照處理，夜晚光強 0LUX，8小時處理；培養室溫度為恒溫25°C。
[0022] 該再生培養過程中，部分再生植株最早在2-3片真葉長出后，就會發生嚴重的花 打頂現象（再生植株在再生培養基上營養生長基本停止，同時連續大量開花直至植株最后 凋亡），發生花打頂現象植株的比例可以超過50 %，有的花打頂植株在沒有進行恢復培養 的情況下，培養了一年之久仍舊在再生培養基上連續開花，不能自行打破花打頂的生理障 礙，嚴重影響再生植株的成苗率。
[0023] 上述各培養基PH值為5. 8,實驗中的器材均采用121°C高壓滅菌20min;該恢復培 養基以MS基本培養基為基礎，添加赤霉素（GA) 0. 3-1. Omg/L (示例性地，可以為0. 3mg/L、 0? 4mg/L、0. 5mg/L、0. 6mg/L、0. 65mg/L、0. 7mg/L、0. 8mg/L、0. 9、1. 0 等中任意或任意兩者之 間的范圍）；
[0024] pH 值為 5. 8;
[0025] 上述MS基本培養基的成分為：
[0026] 大量元素，包括：
[0027]硝酸鉀（KN03):l9〇Omg/L，硝酸銨（NH4N03):l65〇mg/L，
[0028] 硫酸鎂（MgS04 ? 7H20) :370mg/L，磷酸二氫鉀（KH2P04) :170mg/L，
[0029]氯化鈣（CaCl2?2H20) :440mg/L;
[0030] 微量元素，包括：
[0031]硫酸錳（MnS04 ? H20) :16. 9mg/L，硫酸鋅（ZnS04 ? 7H20) :8. 6mg/L，
[0032] 硼酸（H3B03) :6. 2mg/L，碘化鉀（KI) :0? 83mg/L，
[0033]鉬酸鈉（Na2Mo04?2H20) :0? 25mg/L，硫酸銅（CuS04?5H20) :0? 025mg/L，
[0034]氯化鈷（CoCl2?6H20) :0? 025mg/L;
[0035] 鐵鹽，包括：
[0036] 二水合乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA) :37. 3mg/L，硫酸亞鐵（FeS04 ? 4H20): 27. 8mg/L ；
[0037] 有機，包括：
[0038] 甘氨酸：2.Omg/L，鹽酸卩比卩多醇：0? 5mg/L，鹽酸硫胺素：0?lmg/L，煙酸：0? 5mg/L，肌 酸：100mg/L;
[0039]蔗糖：25-30g/L(比如在 25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L 等任意或任意 兩者之間，優選為30g/L);
[0040] 瓊脂：7-12g/L(比如在 7. 0g/L、8. 0g/L、9. 0g/L、10. 0g/L、ll. 0g/L、12. 0 等任意或 任意兩者之間，優選為l〇g/L)。
[0041] 步驟二、恢復培養：將裝有更換完培養基的再生植株的培養瓶，放置于智能人工氣 候箱（購于寧波海曙賽福實驗儀器廠，型號為：PRX-450C-30)中進行恢復培養。
[0042] 恢復培養的光照條件為：白天光照強為度6000LUX-12000LUX (示例性地，可以為 6000LUX、7000LUX、8000LUX、9000LUX、9500LUX、10000LUX、11000LUX、12000LUX 等中任意或 任意兩者之間的范圍，優選為9000LUX)，光照時間12-18h (示例性地，可以為12h、13h、14h、 15h、16h、16. 5h、17h、18h等中任意或任意兩者之間的范圍，優選為16h);夜晚光照強度為 0LUX，光照時間為6h-12h (示例性地，可以為6h、7h、8h、8. 5h、9h、10h、llh、12h等中任意或 任意兩者之間的范圍，優選為8h);
[0043] 恢復培養的溫度條件為：白天溫度為25-30°C (示例性地，可以為25°C、26°C、 27 °C、28 °C、28. 5 °C、29 °C、30 °C等中任意或任意兩者之間的范圍，優選為28 °C );夜晚溫度 為 18-25°C (示例性地，可以為 18°C、19°C、20°C、20. 51：、211：、221：、23、24、251：等中任意 或任意兩者之間的范圍，優選為20°C);
[0044] 恢復培養的濕度條件為：白天空氣濕度為30% -70% (示例性地，可以為30%、 40%、50%、55%、60%、65%、70%等中任意或任意兩者之間的范圍，優選為50%);夜晚空 氣為60% -90% (示例性地，可以為60%、70%、75%、80%、85%、87%、90%等中任意或任 意兩者之間的范圍，優選為85% )。
[0045] 上述培養方法通過添加有赤霉素（GA)的恢復培養基，與光照條件、溫度條件、濕 度條件協同作用，可以使發生花打頂的小植株打破花打頂生理障礙，