本發明涉及植物生物技術領域。更具體地說，本發明涉及一種促進羅漢果cyp24基因表達的方法。
背景技術：
羅漢果是我國特有珍貴藥用和甜料植物，為葫蘆科(cucurbitaceae)羅漢果屬(siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、涼血舒胃、潤腸通便等作用。其主要成分甜苷v是世界上最強的非糖甜味物質之一，為蔗糖甜度的300-400倍，是一種低熱量、純天然的甜味劑及理想的保健品，此外還有抗氧化、免疫調節、抗癌、降血糖等作用。
甜苷v目前還不能化學合成，主要依靠提取獲得。羅漢果對生境要求苛刻，只適宜在廣西生長，且栽培中不能連作，果實中甜苷v含量低，無法滿足市場需求，因此亟待探索提高甜苷v含量的新途徑、新方法。
羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環三萜類物質，本課題組前期根據羅漢果轉錄組數據，已推導出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發生在胞質中，mep途徑發生在質體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉移酶的作用下，形成羅漢果甜苷v。
異戊二烯類物質的產生受到限速酶活性的嚴格調控，一直被認為在其生物合成途徑中起著重要的調控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，cyp450酶基因的表達對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達cyp450酶基因，可以促進羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制cyp450酶基因的表達，羅漢果甜苷v的產量將顯著降低。然而，cyp450酶基因是個超基因家族，本課題組前期研究發現，cyp24與羅漢果甜苷v的合成途徑有一定關聯。現有技術中未見有促進羅漢果cyp24基因表達來提高羅漢果中甜苷v含量的報道。
技術實現要素：
作為各種廣泛且細致的研究和實驗的結果，本發明的發明人已經發現，在羅漢果種植過程中，噴灑含有茉莉酸甲酯的溶液可以刺激并誘導羅漢果中cyp24基因的表達，從而促進cyp450酶基因表達，促進羅漢果甜苷v的生物合成和累積。基于這種發現，完成了本發明。
本發明的一個目的是解決至少上述問題和缺陷，并提供至少后面將說明的優點。
本發明還有一個目的是提供一種通過茉莉酸甲酯對羅漢果組培、育苗、果實發育進行干涉處理來促進cyp24基因表達基因表達的方法，可以有效促進羅漢果中甜苷v含量積累。
本發明還有一個目的是通過組織培養和人工授粉來促進優良植株的選育和規模化種植，進一步促進羅漢果甜苷v的產量。
為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種促進羅漢果cyp24基因表達的方法，包括：將優質羅漢果植株的幼葉進行組織培養，獲得羅漢果組培苗，所述組織培養包括愈傷組織誘導增殖培養和不定芽分化、增殖與萌發培養，其中愈傷組織誘導增殖培養在誘導培養基1中完成，不定芽分化、增殖與萌發培養在誘導培養基2中完成，所述誘導培養基1中茉莉酸甲酯濃度為50～400μmol/l，所述誘導培養基2中茉莉酸甲酯濃度為100～500μmol/l；
在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續噴灑七日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為100～500μmol/l；
植株開花授粉20天后，每隔3日噴灑一次誘導液2，噴灑5次，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為50～100μmol/l。
優選的是，其中，所述誘導培養基1和誘導培養基2中還包括基礎培養基，其配方為ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。
優選的是，其中，所述誘導培養基1或誘導培養基2的制備方法如下：將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20-0.45μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述基礎培養基是高溫蒸汽消毒滅菌且經過降溫的仍是液態的基礎培養基。
優選的是，其中，所述組織培養包括：將所述幼葉切成直徑約1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡數分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺土，用70％酒精浸30～40秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3～5次；將所述葉圓片接種在誘導培養基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養基2上進行分化不定芽，繼續進行繼代增殖獲得組培苗。
優選的是，其中，所述組織培養的條件為：25℃恒溫，相對濕度70％～80％，采用人工光照，每天12小時光照，12小時黑暗培養，光照強度1000～1500lux。
優選的是，其中，將組培苗進行根部處理后用0.1％的高錳酸鉀或10～50mg/l的新潔爾滅溶液浸泡5min滅菌，將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質中，其中所述介質由20～30重量份蛭石、15～20重量份珍珠巖、10～15重量份粘沙、15～20重量份谷殼、10～15重量份鋸木屑、以及10～15重量份磨菇渣組成，隨后根部噴灑10毫克/千克的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日。
優選的是，其中，所述根部處理具體包括：
將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有0.1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，50～200μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
優選的是，其中，所述誘導液1還包括100mg/l甘草次酸，誘導液1噴灑量為每株200g/d，所述誘導液2還包括300mg/l的蘆丁素，誘導液2噴灑量為每株500g/d。
優選的是，其中，還包括人工噴霧授粉，其方法為：在授粉日當天，采摘剛剛開放的雄花，將蕊柱連同花粉剪下倒入噴霧液內，充分搖晃，讓花粉脫離柱頭溶入噴霧液內，最終使得噴霧液呈明顯的黃色，過濾，倒入農用噴霧器內，對著雌花柱頭進行噴灑，噴灑量為每株開花的雌花植株2～5l噴霧液，
其中所述噴霧液的配方為：0.1～0.3g/l硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.02～0.062,4–d+0.01～0.03g/l甘草次酸+水。
優選的是，其中，所述誘導培養基中還包括有50μmol/l2,4-表油菜素內酯。
本發明至少包括以下有益效果：
由于組織培養過程中加入了茉莉酸甲酯的溶液，長期內以刺激并誘導羅漢果中cyp24基因的表達，從而促進cyp450酶基因表達，促進羅漢果甜苷v的生物合成，提高其產量；
由于組織培養開始刺激羅漢果cyp24基因表達的方法，因此植株對于該成分敏感，在授粉掛果后噴灑繼續茉莉酸甲酯的溶液，對于促進基因表達的反饋更加敏感，可以增加羅漢果中甜苷v的累積；
由于誘導液中增加甘草次酸和蘆丁素，因此輔助茉莉酸甲酯對于cyp24基因表達的協同刺激，從而對羅漢果中甜苷v的累積有促進作用。
由于植株移植過程中進行根部處理，也增加了茉莉酸甲酯，因此植株定植生長過程中cyp24基因有刺激作用，可以促進羅漢果甜苷v的生物合成。
由于統一人工授粉，使得果實可以在后期誘導液噴灑時，同時接受刺激，有效的促進cyp24基因的集中表達，從而進一步提高羅漢果甜苷v的含量，并且有利于統一采摘管理等；
本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
<實例1>
配置誘導培養基：根據配方：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭配置基礎培養基，將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述誘導培養基1中茉莉酸甲酯濃度為50μmol/l，所述誘導培養基2中茉莉酸甲酯濃度為100μmol/l；
組織培養：將優質羅漢果植株的幼葉進行組織培養，將所述幼葉切成直徑1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺上，用70％酒精浸30秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3次；將所述葉圓片接種在誘導培養基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養基2上進行分化不定芽，繼續進行繼代增殖獲得組培苗。
移植種植：將組培苗用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡滅菌；將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質中，其中所述介質由20重量份蛭石、15重量份珍珠巖、10重量份粘沙、15重量份谷殼、10重量份鋸木屑、以及10重量份磨菇渣組成；移栽后在葉面噴灑10毫克/千克的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日；在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續噴灑7日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為100μmol/l
授粉后噴灑：植株開花授粉后20天，連續噴灑7天的誘導液2，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為50μmol/l。
<實例2>
配置誘導培養基：根據配方：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭配置基礎培養基，將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述誘導培養基1中茉莉酸甲酯濃度為400μmol/l，所述誘導培養基2中茉莉酸甲酯濃度為500μmol/l；
組織培養：將優質羅漢果植株的幼葉進行組織培養，將所述幼葉切成直徑1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺上，用70％酒精浸30秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3次；將所述葉圓片接種在誘導培養基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養基2上進行分化不定芽，繼續進行繼代增殖獲得組培苗。
移植種植：將組培苗用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡滅菌；將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質中，其中所述介質由20重量份蛭石、15重量份珍珠巖、10重量份粘沙、15重量份谷殼、10重量份鋸木屑、以及10重量份磨菇渣組成；移栽后在葉面噴灑10毫克/千克的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日；在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續噴灑7日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為500μmol/l
授粉后噴灑：植株開花授粉后20天，連續噴灑7天的誘導液2，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為100μmol/l。
<實例3>
配置誘導培養基：根據配方：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭配置基礎培養基，將茉莉酸甲酯通過2％的乙醇水溶液(v/v)溶解配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，通過無菌的孔徑0.20μm的硝酸纖維素膜進行過濾殺菌，將殺菌后的母液添加到所述基礎培養基中，使得茉莉酸甲酯達到所需的濃度，其中所述誘導培養基1中茉莉酸甲酯濃度為200μmol/l，所述誘導培養基2中茉莉酸甲酯濃度為300μmol/l；
組織培養：將優質羅漢果植株的幼葉進行組織培養，將所述幼葉切成直徑1cm的葉圓片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分鐘，后用蒸餾水沖洗干凈，再在超凈工作臺上，用70％酒精浸30秒取出，隨后用hgcl2水溶液消毒8分鐘，用無菌水沖洗3次；將所述葉圓片接種在誘導培養基1上誘導愈傷組織，愈傷組織繼代增殖數次后，取生長旺盛、生活力強的愈傷組織，切成直徑lcm的小塊；將所述小塊接種在誘導培養基2上進行分化不定芽，繼續進行繼代增殖獲得組培苗。
移植種植：將組培苗用0.1％的高錳酸鉀溶液浸泡滅菌；將滅菌的組培苗移栽到滅菌的介質中，其中所述介質由20重量份蛭石、15重量份珍珠巖、10重量份粘沙、15重量份谷殼、10重量份鋸木屑、以及10重量份磨菇渣組成；移栽后在葉面噴灑10mg/l的abt生根粉溶液一次，然后進行遮光5日；在所述羅漢果組培苗移栽20～30日后的在葉面噴灑滴灌誘導液1，連續噴灑7日，其中所述誘導液1中茉莉酸甲酯為250μmol/l
授粉后噴灑：植株開花授粉后20天，連續噴灑7天的誘導液2，其中所述誘導液2中茉莉酸甲酯為75μmol/l。
<實例4>
在實施例3的基礎上，對移栽進行根部處理將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，50μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
<實例5>
在實施例3的基礎上，對移栽進行根部處理將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，200μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
<實例6>
在實施例3的基礎上，對移栽進行根部處理將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2～3條粗壯根用無菌針分別刺穿2-3個傷口，傷口深度小于0.1mm，再將所有根部浸泡在浸泡液中，連續變溫處理3次，然后瀝干備用，
其中所述變溫處理均為將根系先置于4℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min，
所述浸泡液含有1μg/l的納米銀、3mg/l的abt生根粉、0.15g/l葡甘露聚糖，100μmol/l茉莉酸甲酯，以磁化水為溶劑。
<實例7>
在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp24基因表達的方法，所述誘導液1中還包括100mg/l甘草次酸。
<實例8>
在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp24基因表達的方法，所述誘導液1中還包括有300mg/l的蘆丁素。
<實例9>
在實施例3的基礎上，增加人工授粉，在授粉日當天，采摘剛剛開放的雄花，將蕊柱連同花粉剪下倒入噴霧液內，充分搖晃，讓花粉脫離柱頭溶入噴霧液內，最終使得噴霧液呈明顯的黃色，過濾，倒入農用噴霧器內，對著雌花柱頭進行噴灑，噴灑量為每株開花的雌花植株2～5l噴霧液，其中，所述噴霧液的配方為：0.1/l硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.022,4–d+0.01g/l甘草次酸+水。
<實例10>
在實施例3的基礎上，所述誘導培養基中還包括有50μmol/l2,4-表油菜素內酯。
為了說明本發明的效果，發明人提供比較實驗如下：
<比較例1>
在調配物質誘導培養基時，誘導培養基1中茉莉酸甲酯的含量為0，其余參數與實例3中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<比較例2>
在調配物質誘導培養基時，誘導培養基2中茉莉酸甲酯的含量為0μmol/l，其余參數與實例3中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<比較例3>
在移植種植時，誘導液1的中茉莉酸甲酯的含量為0，其余參數與實例3中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<比較例4>
在授粉后噴灑，誘導液2的中茉莉酸甲酯的含量為0，其余參數與實例2中的完全相同，工藝過程也完全相同。
<空白組>
參照實施例1，其中各個步驟中均不添加茉莉酸甲酯其余參數與實例1中的完全相同，工藝過程也完全相同。
測量方法：
1、cyp24基因表達量測定方法：利用abi7500實時熒光定量pcr儀，采用qrt-pcr檢測cyp24基因的表達。
步驟一：樣品前處理：采集羅漢果果實，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。
步驟二：先采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna；
步驟三：將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；
步驟四：采用primerpremier5.0軟件設計引物，其中，cyp24引物序列為：
fp：gattctacggcgatattcctt，
rp：aatggatgaagtatgacctgaa；
內參基因用ubq5，
序列為fp：ataaaagacccagcaccacattc，
rp：cccttgccgactacaacatcc；
步驟五：qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl；反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
2、羅漢果甜苷v含量：采用高效液相色譜法，具體方法參考《廣西中醫學院學報》第2007年04期上發表的“hplc測定羅漢果中羅漢果甜苷v的含量”一文。
采集羅漢果果實，烘干備用。將樣品經70％甲醇溶液提取溶解，采用c18反相色譜柱分離，用乙腈-0.1％磷酸溶液(22∶78)為流動相進行洗脫，檢測波長為203nm，流速為lml/min，以色譜峰保留時間和紫外可見光譜進行定性，外標法進行定量。
表1不同實施例和比較例方法對羅漢果cyp24基因表達量和甜苷v含量的影響
注：誘導培養基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實cyp24基因表達量以未經茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實cyp24基因表達量是1為參照；上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。
從上表1能夠看出，實例中由于在誘導培養基、誘導液中添加了茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量顯著高于未添加的情況。并且實例中茉莉酸甲酯成分的比例控制在一定范圍之間之間，如果超過，其促進作用不明顯。
比較例1與實例3相比，誘導培養基1中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量明顯下降，但是對比空白依舊有明顯的增加。
比較例2與實例3相比，誘導培養基2中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量明顯下降，但是對比空白依舊有增加，且增加的幅度略大于比較例1。
可見，本發明的在愈傷組織培養階段進行刺激的效果更加明顯；
比較例3與實例2相比，誘導液1中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量下降，但是對比空白有明顯的增加。
比較例4與實例2相比，誘導液2中未添加茉莉酸甲酯，其cyp24基因表達量和甜苷v含量下降，但是對比空白有明顯的增加，且增加的幅度略小于比較例1。
可見，本發明的在坐果后對果實的培養階段進行刺激的效果相較于育苗階段更加明顯；
實施例4與實例3相比，根部處理中茉莉酸甲酯濃度50μmol/l，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例5與實例3相比，根部處理中茉莉酸甲酯濃度200μmol/l，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例6與實例3相比，根部處理中茉莉酸甲酯濃度100μmol/l，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
可見，本發明在移栽錢進行根部處理，添加茉莉酸甲酯可以促進cyp24基因表達量和甜苷v含量增加，并且其濃度范圍為50～200μmol/l均有良好的促進效果。
實施例7與實例3相比，誘導液1中含有甘草次酸，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例8與實例3相比，誘導液2中含有蘆丁素，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
可見，在誘導液中增加甘草次酸和蘆丁素可以促進cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
實施例6與實例3相比，進行人工授粉，并且在噴霧液中增加甘草次酸，其cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
可見，人工授粉中額外增加甘草次酸可以促進cyp24基因表達量和甜苷v含量增加。
盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用。它完全可以被適用于各種適合本發明的領域。對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改。因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實例。