一種培育近異源四倍體玉米材料的方法與流程

本發明屬于玉米遠緣雜交育種方法領域，具體涉及一種培育近異源四倍體玉米材料的方法。

背景技術：

玉米是糧飼兼用作物，也是重要的工業原料。隨著人們生活水平的提高，對玉米的需求也急劇增加。提高單產是提高玉米產量的主要途徑，但是由于存在玉米種質遺傳基礎狹窄問題，限制了突破性玉米品種的培育。因此，為滿足生產和生活的需要，迫切需要拓寬和創制新的玉米種質資源。

大芻草和摩擦禾等玉米近緣野生種在長期的進化過程中形成了各種不同的優良基因；如大芻草對玉米大、小斑病有很強的抗性，對某些病毒病免疫，還具有抗逆性強和適應性廣等優點；摩擦禾具有良好的抗病蟲性，如對玉米根螟、玉米螠管蚜具有抗性，抗銹病、抗玉米大斑病，摩擦禾還具有抗寒、抗旱、耐鹽堿等優良特性；此外，摩擦禾還具有籽粒營養豐富，蛋白質含量高，消化率比較高等優點。玉米近緣野生種的這些優良特性可用于拓寬玉米的種質基礎。但是由于親緣關系較遠，存在生殖隔離等原因，它們和玉米雜交后存在不能結實，或者雜交后代不育或者育性極低，使近緣野生種的有益基因難以導入到玉米材料中。

mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)是四川農業大學以引自美國的四倍體玉米(zeamaysl.，4n＝40)和四倍體鴨茅狀摩擦禾(或稱指狀摩擦禾，tripsacumdactyloidesl.，2n＝72)之間的屬間雜種f1為母本，以四倍體多年生類玉米(zeaperennis，2n＝40)為父本雜交而獲得的玉米異源六倍體；mtf-1的染色體數為76，是一個包含全套玉米染色體組(20條)、鴨茅狀摩擦禾染色體組(36條)和四倍體多年生類玉米染色體組(20條)的屬間雜種，是一個自然界不存在的新物種。四川農業大學將mtf-1分類命名為玉黍禾屬玉淇淋草種，將其拉丁文分類名稱命名為tripsazeacreammaizet.。

mtf-1具有雌性可育的特性，以玉米(zeamaysl.)、大芻草(zeaperennisl.)或摩擦禾(tripsacumdactyloidesl.)為父本給mtf-1授粉都可產生結實后代。利用此特性，以mtf-1為橋梁材料，可將大芻草或摩擦禾中的有益基因轉移到玉米中。但是由于mtf-1存在多年生、分蘗多等野生特性，其應用受到較大限制。目前，mtf-1主要用于培育多年生、分蘗多且無性繁殖的飼草玉米品種(cn103609428a，cn103548674a)，難以直接在玉米育種中應用。

經檢索，沒有發現以mtf-1作為橋梁將大芻草和摩擦禾有益基因轉育到玉米材料中的報道。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種培育近異源四倍體玉米材料的方法。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種培育近異源四倍體玉米新材料的方法，包括如下步驟：

(1)、在吐絲散粉期，以mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)為母本，以玉米(zeamaysl.,2n＝20)為父本進行雜交，成熟時收獲種子，獲得f1代；

(2)、種植f1代，在抽雄期用碘-碘化鉀染色法對f1代材料進行花粉育性檢測；選擇花粉有育性的植株進行自交，成熟時收獲種子，獲得f2代；

(3)、種植f2代，從三葉期開始至抽雄期前均可取根尖，采用基因組原位雜交的方法對根尖染色體數目和染色體組成進行鑒定，并對f2代植株的分蘗數進行調查；在抽雄期用碘-碘化鉀染色法對花粉育性進行檢測；選擇根尖染色體總數為41～43條，其中含有玉米(zeamaysl.)染色體數25～26條、四倍體多年生類玉米(zeaperennisl.)染色體數14～15條、指狀摩擦禾(tripsacumdactyloidesl.)染色體數1～2條、分蘗數為1～3個，且花粉育性大于40％的植株進行自交，成熟時收獲種子，獲得f3代；

(4)、種植f3代，按照步驟(3)所述的基因組原位雜交方法對根尖染色體數和染色體組成進行鑒定，并在抽雄期用碘-碘化鉀染色法對花粉育性進行檢測；選擇染色體總數為39～40條，其中含有玉米染色體數24～28條、四倍體多年生類玉米染色體數12～15條、指狀摩擦禾染色體數0～2條，無分蘗、且花粉育性大于50％的植株進行自交，成熟時收獲種子，獲得f4代；

(5)、種植f4代，按照步驟(3)所述基因組原位雜交方法對根尖染色體數和染色體組成進行鑒定，并在抽雄期用碘-碘化鉀染色法對花粉育性進行檢測；檢測結果中染色體總數為38～40條，其中含玉米染色體數為22～28條、四倍體多年生類玉米染色體數為12～15條、指狀摩擦禾染色體數為0～2條，無分蘗、且花粉育性大于70％的植株；這種染色體總數在40條左右，且同時含有玉米、四倍體多年生類玉米或指狀摩擦禾兩個或兩個以上物種染色體組的植株，即為本發明近異源四倍體玉米材料；對所選植株自交留種。

上述方法步驟(1)中所述的mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)(蘇月貴，四川農業大學碩士論文，2009)是四川農業大學以引自美國的四倍體玉米(zeamaysl.4n＝40)和四倍體鴨茅狀摩擦禾(或稱指狀摩擦禾，tripsacumdactyloidesl.，2n＝72)之間的屬間雜種f1為母本，以四倍體多年生類玉米(zeaperennis，2n＝40)為父本雜交育成的玉米異源六倍體；mtf-1的染色體數為76，是一個包含全套玉米染色體組(20條)、鴨茅狀摩擦禾染色體組(36條)和四倍體多年生類玉米染色體組(20條)的屬間雜種，是一個自然界不存在的新物種。

所述的玉米異源六倍體mtf-1(tripsazeacreammaizet.)為多年生，無性繁殖，植株茁壯，直立叢生，根系發達；抽雄時期平均株高為310cm，抽雄期后株高最高可達335cm，主莖粗9.8-12.9mm，抽雄期單株分蘗達50-60個，分蘗與主莖莖粗差異不明顯，且整個生命周期中不斷生成新的根分蘗；葉片深綠細長，葉長61-81cm，葉寬5.1-5.9cm，單個莖稈葉片數為20-23片；主莖頂端雄花屬圓錐花序，花序長27-30cm，花粉高度不育，莖稈節點上著生5-7個分枝，分枝頂端為穗狀花序的雌花，9-18個小穗在穗軸上呈雙行或四行對生排列。植株雄穗、葉鞘和苞葉均為深紫色。mtf-1雜交可獲得少量種子，種子穎殼堅硬，呈褐色或灰褐色。植株抗寒抗澇能力強，在0-5及長期水淹條件下仍能持續長出新分蘗。

mtf-1主要通過分兜繁殖、莖稈扦插或其他無性繁殖方式等無性繁殖方法進行繁殖。公眾可從四川農業大學獲得mtf-1(tripsazeacreammaizet.2n＝76)生物材料。

上述方法步驟(1)中所述的玉米是指自交系、雜交種、農家種或綜合種等。

上述方法步驟(2)、(3)、(4)或(5)中所述的碘-碘化鉀染色法參照蘇月貴碩士論文(四川農業大學碩士論文，2009)。

上述方法步驟(3)、(4)或(5)中所述的基因組原位雜交方法參照tangq等2005年公開的方法(tangq等.cropsci,2005,45:717-721)。

上述方法步驟(5)中所述的近異源四倍體玉米材料，其染色體數為40條左右(約為玉米染色體基數10的4倍)，且染色體來源于不同的物種(同時含有玉米，四倍體多年生類玉米和/或指狀摩擦禾的染色體)，故稱為近異源四倍體玉米。

上述方法中選育出的近異源四倍體玉米材料，可以用來組配雜交材料，可作為中間橋梁材料，將近緣野生種的優良基因導入到普通二倍體玉米中，拓寬玉米的種質基礎。

本發明具有的優點和有益效果：本發明首次育成染色體總數為40條左右、并包含玉米和四倍體多年生類玉米染色體，或還含有摩擦禾染色體的、有育性的近異源四倍體玉米材料，即本發明首次育成了非整倍性染色體情況下花粉可育的近異源四倍體玉米。該近異源四倍體玉米的性狀逐漸趨向于二倍體玉米，并且花粉育性高，可作為橋梁將四倍體多年生類玉米或摩擦禾等近緣野生種中存在的有益基因轉移到栽培玉米中，為拓寬玉米種質基礎提供了很好的工具，同時也為玉米基因功能等遺傳研究提供了很好的材料。

附圖說明

圖1.為實施例1步驟(2)中f1代的雙色基因組原位雜交顯微照片。

圖2.為實施例1步驟(2)中f1代的花粉育性檢測顯微照片。

圖3.為實施例1步驟(3)中f2代雙色基因組原位雜交顯微照片。

圖4.為實施例1步驟(3)中f2代花粉育性檢測顯微照片。

圖5.為實施例1步驟(4)中f3代雙色基因組原位雜交顯微照片。

圖6.為實施例1步驟(4)中f3代花粉育性檢測顯微照片。

圖7.為實施例1步驟(5)中f4代雙色基因組原位雜交顯微照片。

圖8.為實施例1步驟(5)中f4代花粉育性檢測顯微照片。

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發明做進一步的解釋和說明，但是不對本發明保護范圍構成任何限制。

實施例1：本發明近異源四倍體玉米材料的培育

(1)、2011年4月，在溫江農場種植玉米自交系mo17和玉米異源六倍體mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76；公眾可從四川農業大學獲取mtf-1的生物材料)；2011年6月，以玉米異源六倍體mtf-1為母本，以mo17為父本進行雜交，成熟時收獲種子，獲得f1代，保存于-20℃冰箱中；

(2)、2012年4月，從-20℃冰箱中取出f1代種子，在四川農業大學溫江農場種植f1代；2012年5月中旬至6月中旬取f1根尖，用基因組原位雜交方法((參見tangq等.cropsci,2005,45:717-721))進行染色體數目和染色體組成鑒定，結果發現f1代材料的染色體總數為35-86條,其中含有玉米染色體數(以下簡稱為：mz)為12-30條，四倍體多年生類玉米染色體數(以下簡稱為zp)為8-20條，指狀摩擦禾染色體數(以下簡稱為tr)為15-36條，且不同物種染色體之間發生部分易位。2012年6月用碘-碘化鉀染色法(參照蘇月貴，四川農業大學碩士論文，2009)對f1代材料進行花粉育性檢測，發現編號為f1-31的材料花粉有育性，其育性為37.5％(見圖2)；f1-31材料的染色體數目為54條，其中含有mz為28條，zp為11條，tr為15條(見圖1)；通過對f1-31的農藝性狀觀察，發現f1-31植株為一年生，植株分蘗數為3個，且種子部分被穎殼包被，脫粒困難；由于f1-31有育性，所以對其進行自交，成熟時收獲，得f2代；

(3)、2013年4月，在四川農業大學溫江農場種植f2代，2013年5月至6月取根尖用基因組原位雜交方法進行染色體數目和染色體組成的鑒定選擇染色體數目為41-43條，其中mz為25-26條,zp為14-15條,tr為1-2條(見圖3，染色體總數為43條，其中2tr+15zp+26mz)，分蘗數為1-3個，花粉育性為大于40％(見圖4)的植株自交，共自交9株，對f2代農藝性狀觀察，發現f2中大部分植株表現為栽培玉米型，無分蘗、主莖粗壯，f2中各農藝性狀還處于瘋狂分離階段,大部分種子依然被穎殼包被，但有部分種子已經開始裸露，種子脫粒困難；于2013年8月下旬至9月上旬收獲種子，獲得f3代。

(4)、2014年4月，在四川農業大學溫江種植f3代材料，2014年5月至6月取f3代材料根尖，按照步驟(2)中所述基因組原位雜交方法對f3代材料進行染色體數目和組成的鑒定；在抽雄期用碘-碘化鉀染色法對花粉育性進行檢測；選擇染色體數目為39-40條，其中含有mz為24-28條，zp為12-15條，tr為0-2條，(見圖5，染色體總數為39條，其中包括mz24條和zp15條)，無分蘗，花粉育性為大于50％(見圖6)的植株自交，共自交70株；通過對f3材料的農藝性狀觀察，發現f3植株多數為栽培玉米型，主莖纖細、無分枝，大部分果穗的籽粒裸露，容易脫粒，少部分籽粒被穎殼包被，脫粒困難；于2014年8月下旬至9月上旬收獲種子，獲得f4代。

(5)、2015年4月，在四川農業大學溫江種植f4代材料，2015年5月至6月取f4代材料根尖，按照步驟(2)中所述的基因組原位雜交方法對f4代材料進行染色體數目和染色體組成的鑒定；選擇f4材料中染色體總數為38-40條，其中含有mz22-28條，zp12-15條，tr0-2條(見圖7，染色體總數40條，其中包括mz24條和zp15條)；無分蘗，花粉育性為大于70％(見圖8)的植株，即為本發明近異源四倍體玉米材料；將所選136株自交；對f4材料的農藝性狀觀察，發現f4材料多數植株表現為栽培玉米型，極少數植株分蘗、無分枝、主莖纖細，幾乎所有籽粒已經完全裸露，籽粒形態也越來越趨向普通玉米，并且脫粒較為容易，2015年8月下旬至9月上旬收獲種子，保留收獲的種子。

實施例2本發明近異源四倍體玉米材料的應用

(1)2016年10月，在四川農業大學云南西雙版納基地種植實施例1所得的近異源四倍體玉米17株，同時種植同源四倍體玉米v182。

(2)2016年12月，以步驟中(1)所述的近異源四倍體玉米為母本，以v182為父本雜交授粉；2017年2月獲得雜交種；所得雜交種籽粒形態大而飽滿。

(3)2017年3月，在四川農業大學溫江種植步驟(2)中獲得的雜交種種子20粒，成活18株，成活率為90％；所得雜交材料莖稈粗壯，葉片綠而肥大，生長勢優于其親本材料(近異源四倍體玉米或同源四倍體玉米v182)，具有明顯的雜種優勢。

(4)2017年6月，在抽雄期用碘-碘化鉀染色法方法對雜交種花粉育性進行檢測，結果表明其花粉有育性，因此，可以進行遺傳基因的傳遞。

上述結果說明本發明非整倍性的近異源四倍體玉米雌性可育，以其作為母本與玉米雜交，可產生可育的雜交后代，因而，本發明近異源四倍體玉米材料可作為將近緣野生種中的優良基因轉移至玉米中的橋梁材料。

實施例3本發明近異源四倍體玉米材料的應用

(1)2016年10月，在四川農業大學云南西雙版納基地種植實施例1所得的近異源四倍體玉米材料14株，同時種植玉米自交系mo17。

(2)2016年12月，以mo17為母本，以步驟中(1)所述的近異源四倍體玉米為父本雜交授粉；2017年2月獲得雜交種；所得雜交種籽粒形態大而飽滿。

(3)2017年3月，在四川農業大學溫江種植步驟(2)中獲得的雜交種種子48粒，成活23株，成活率為48％；所得雜交材料莖稈粗壯，葉片綠而肥大，生長勢優于其親本材料(近異源四倍體玉米或玉米自交系mo17)，具有明顯的雜種優勢。2017年6月，在抽雄期用碘-碘化鉀染色法方法對雜交后代花粉育性進行檢測，檢測結果其花粉有育性。

以上結果說明本發明非整倍性的近異源四倍體玉米材料有育性，產生正常的花粉，用其作為父本給玉米材料授粉，并可產生雜交后代，因此，可作為將近緣野生種中的優良基因轉移至玉米中的橋梁材料。