本發明屬于植物繁殖方法技術領域，具體涉及到一種綠嶺核桃體細胞胚育苗方法。
背景技術：
綠嶺核桃品種是河北農業大學、河北綠嶺果業有限公司1999年在5年生香玲中發現的優良變異單株。2005年通過河北省林木品種審定委員會審定，是河北省林木種質資源普查主栽經濟林品種和審定品種重點調查內容。其品種的生物學特征為：堅果卵圓形，淺黃色，三徑平均為3.42cm，平均單果重12.8g。殼厚0.8mm，均勻不露仁，縫合線平滑而不突出，果面光滑美觀，用手輕輕一捏就可剝開；內種皮淡黃色，無澀味，種仁飽滿濃香。出仁率67％以上，果仁顏色淺黃，營養豐富，脂肪含量67％(香玲65.48％)、蛋白質含量22％(香玲21.43％)。與香玲相比，果殼薄、個大、出仁率高，果形美觀，蛋白質、脂肪含量均比香玲高。雄先型品種。以中短枝結果為主，果枝率88.5％，雙果率22.4％。早實、豐產，栽植第二年可結果。五年進入盛果期，平均畝產200kg以上。抗逆性與抗病性較強，耐旱。對細菌性褐斑病和炭疽病具有較強的抗性，病果率小于3.5％。
核桃的繁殖是產品推廣的重要基礎工作，而傳統的育苗方法難以滿足穩定的品種遺傳轉化的要求。
技術實現要素：
本發明的目的提供一種綠嶺核桃體細胞胚發生方法，為實現發明的目的，本發明提供以下技術方案：
一種綠嶺核桃體細胞胚育苗方法，包括以下過程：
(1)將核桃幼胚外植體消毒處理，達到無菌要求；
(2)將核桃幼胚外植體轉接到愈傷組織培養基中進行培養，誘導產生愈傷組織；
(3)將誘導的愈傷組織轉接到誘導體細胞胚培養基中進行培養；
(4)將質量好的體細胞胚轉接到叢生芽誘導培養基中進行叢生芽培養；
(5)經過叢生芽培養的健壯芽接種到壯苗培養基中進行壯苗培養；
(6)經過壯苗培養的無根苗接種到生根培養基進行生根培養；
(7)選擇根系長到2-3cm的生根苗進行煉苗移栽，應用草炭土和珍珠巖配成的混合基質。
具體的，步驟(1)中，所述的外植體消毒方法：用75％的酒精處理外植體30s，用無菌水沖洗5遍，再用0.1％的氯化汞消毒3-5分鐘，再用無菌水沖洗5遍。
步驟(2)中所述的愈傷組織培養基，為在按規定量稱取1lwpm培養基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba1.0mg、naa0.5mg，用純凈水定容至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，暗培養，培養時間30天。
步驟(3)中所述的誘導體細胞胚培養基，是在按規定量稱取1lwpm培養基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba1.0mg、tdz0.01mg、naa0.5mg，用純凈水定容至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間45天。
步驟(4)中所述的叢生芽誘導培養基，是為在按規定量稱取1lwpm培養基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba1.0mg、zt0.5mg、naa0.5mg，用純凈水定容至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間60天。
步驟(5)中所述的壯苗培養基，是為在按規定量稱取1lwpm培養基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba0.5mg、naa1mg，用純凈水定容至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間60天。
步驟(6)中所述的生根培養基，在按規定量稱取1lwpm培養基其中大量元素減一半，添加蔗糖20g、瓊脂粉6.5g、活性炭1g、iba1.5mg，用純凈水定容至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間70天。
具體的說明，1升wpm基本培養基，包括以下元素，大量元素：nh4no3400mg；(nh4)2so4132mg；mgso4.7h2o370mg；kh2po4170mg；kno3400mg；k2so4900mg；鈣鹽：cacl296mg；ca(no3)2·4h2o556mg；微量元素：h3bo36.2mg；mnso4.h2o22.3mg；na2moo4·2h2o0.25mg；cuso4.5h2o0.025mg；znso4·7h2o8.6mg；鐵鹽：na2-edta37.3mg；feso4.7h2o27.8mg；維生素：肌醇100mg；煙酸(維生素pp)0.5mg；鹽酸吡多醇0.5mg；鹽酸硫胺素0.5mg；甘氨酸2mg。
步驟(7)所述的草炭土：珍珠巖的質量比為3:2。
本發明提供的一種綠嶺核桃體細胞胚育苗方法，通過誘導核桃體細胞胚的方法建立植株再生的方法，為建立綠嶺核桃品種遺傳轉化體系奠定基礎。
具體實施方式
本發明通過誘導綠嶺核桃體細胞胚的發生方式達到植株再生繁殖的目的，具體方法如下：
(1)處理外植體用冷水浸泡一周，每天換水一次，然后太陽下暴曬，裂開即可發芽，待發芽后，在超凈工作臺上取出完整的幼胚作為外植體備用。
(2)消毒處理，首先在超凈工作臺上用75％酒精處理30s，用無菌水沖洗5次，0.1％的氯化汞處理3-5分鐘，再用無菌水沖洗5遍。
(3)外植體誘導愈傷組織將消毒后的外植體接種到愈傷組織培養基中，以wpm為基本培養基添加蔗糖30g，瓊脂粉6.5g，6-ba1.0mg，naa0.5mg，用純凈水定容到1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，暗培養，培養時間30天。
(4)愈傷組織經過再分化選擇質地呈顆粒狀，顏色淺紅色的愈傷組織，轉接到再分化培養基中。培養基為wpm基本培養基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，6-ba1.0mg，tdz0.01mg，naa0.5mg，純凈水定容至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間45天。
(5)叢生芽培養將體細胞胚轉接到叢生芽誘導培養基，培養基以wpm為基本培養基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，6-ba1.0mg，zt0.5mg，naa0.5mg，定容水至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間60天。
(6)壯苗培養經過叢生芽誘導后細小芽，轉接到壯苗培養基，培養基以wpm為基本培養基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，6-ba1.0mg，naa1.0mg，定容水至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間45天。
(7)生根培養經過壯苗培養后，選擇2-3cm長的芽苗轉接到生根培養基中，培養基以1/2wpm為基本培養基添加蔗糖20g，瓊脂6.5g，活性炭1g，iba0.5mg，iaa0.3mg，定容水至1升，調整ph值6.5-6.8，培養溫度25±2℃，光照強度3500iux，培養時間60天。
(8)煉苗移栽在生根培養基中根長到2-3cm時，即可煉苗移栽。移栽前先將瓶苗置于溫室中馴化7天左右，打開瓶蓋放置3天，用鑷子將苗輕輕取出，用溫水洗凈培養基后用1％的多菌靈浸泡4分鐘，栽入育苗穴盤中，移栽組培苗基質比例：草炭土：珍珠巖為3:2，澆透水，用塑料薄膜遮陽3-5天。