一種小菘菜細胞質雄性不育系及保持系的選育及繁殖方法與流程

本發明屬于十字花科蕓薹屬蔬菜新品種選育技術領域，涉及一種小菘菜細胞質雄性不育系及保持系的選育及繁殖方法。

背景技術：

小菘菜（學名：brassicacampestrisssp．chinensis(l.)makino；染色體組aa，2n=20）是十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個變種，屬于不結球葉用蔬菜。小菘菜原種產于中國，后被日本引進并進行了改良，經過改良的小菘菜具有良好的保健作用。小菘菜的特點是花器小，角果數及角果粒數少、因而制種產量低，不能滿足生產用種需求，利用f1雜種優勢對于提高小菘菜制種產量及蔬菜產量具有重要意義。關于小菘菜雜交品種的選育方面，其母本選育主要集中三個方面：第一、隨著小菘菜品系的高世代純化，逐漸表現出自交不親和特點，因而可以利用自交不親和的特點配制雜交組合；第二、選育核不育材料為母本，尉利花等（尉利花,楊寧,馮輝.小菘菜核基因雄性不育系的創制[j].沈陽農業大學學報,2013,44(6):743-747.）利用復等位基遺傳的白菜核基因雄性不育系06sxl10為不育源，完成了小菘菜細胞核雄性不育系的選育，經檢測發現其不育率達到100%。第三、選育細胞質雄性不育系為母本，邵貴榮等（邵貴榮,陳文輝,方淑桂,等.小菘菜異源胞質雄性不育系cms08-6的選育[j].福建農業學報,2009,24(2):113-116.）利用大白菜異源胞質雄性不育系cms22-3為不育源，選育出了小菘菜細胞質雄性不育系。

花色苷是一種植物的次生代謝產物，經過多年的研究證明，花色苷具有抗氧化、提高還原力、減少腫瘤發病率、保護肝臟等眾多的生物學保健功能（唐傳核,彭志英.天然花色苷類色素的生理功能及應用前景[j].冷飲與速凍食品工業,2000,6(1):26-28.）。花色苷主要存在于植物葉片、花朵及果實中。目前，選育花色苷含量高的蔬菜品種對于豐富蔬菜品種市場及提高人們的生活水平具有重要意義。

我國的小菘菜品種資源多來源于日本，關于小菘菜不育系親本的選育現在還處于起步階段，僅有上述少量的核不育系及細胞質不育系的報道，同時尚無高花色苷含量小菘菜品種選育報道，因而構建更多不同胞質來源的小菘菜高花色苷含量不育系對小菘菜新品種選育及提高小菘菜制種產量具有重要意義。

技術實現要素：

為了克服現有技術的上述缺點，本發明提供一種小菘菜細胞質雄性不育系及保持系的選育及繁殖方法，解決了小菘菜高花色苷含量不育系短缺的現狀，不育性不受溫度和光照條件影響，非常穩定和徹底；沒有任何死蕾和苗期黃化現象；與目前已報道的小菘菜不育胞質來源不同的新型不育胞質；葉片呈紫色，含有豐富的花色苷成分。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種小菘菜細胞質雄性不育系及保持系的選育，它以cms63-5為母本，以小菘菜sgz900為輪回親本，通過多代連續回交，結合栽培試驗、抗性鑒定、育性鑒定及花色苷含量鑒定得到了遺傳穩定、抗病性強、生長性狀優良的小菘菜細胞質雄性不育材料；再以sgz901為父本雜交，獲得了小菘菜細胞質雄性不育系及其保持系；具體選育步驟如下：

1、高花色苷含量親本選擇

選用兩個高花色苷含量親本，來源分別：6-1029，為紫葉甘藍型油菜高世代自交系，來源為華中農業大學傅廷棟院士課題組；紫332，為韶關學院選育的紫葉白菜自交系；

2、父本的選育

分別以日本引進小菘菜品種為親本，采用常規育種途徑結合抗病、豐產性鑒定，選育出抗病耐抽薹的小菘菜優良自交系sg900及sg901；

3、不育胞質來源的選擇

haucms是華中農業大學傅廷棟院士發現的一種細胞質雄性不育系，其構建的大白菜細胞質雄性不育系為cms63-5（專利公開號為：cn1849881a），本發明以該不育系材料為不育胞質來源；

4、高花色苷含量中間親本的選育

以6-1029為母本，sg901為父本，采用人工撥蕾去雄方式雜交授粉，選擇后代中表型為高花色苷含量的單株為母本，以sg901為輪回親本回交8代，得到紫葉高花色苷含量單株sgz901；

以紫332為母本，sg900為父本，采用人工撥蕾去雄方式雜交授粉，選擇f1后代中高花色苷單株自交，提取f2群體每個單株的花色苷含量，進行高花色苷含量單株篩選，選擇含量最高的單株為母本，以sg900為輪回親本，采用人工撥蕾方式雜交授粉，回交6代自交1代，得到sgz900；

5、不育材料的選育

以cms63-5為母本，sgz900為父本，在抗病性鑒定及育性鑒定的基礎上，采用撥蕾授粉方法獲得f1，再對f1進行抗病性鑒定、花色苷含量分析及育性鑒定，選擇抗病性良好、花色苷含量高、非輪回親本的不育單株為母本，sgz900為父本（輪回親本），經過8次回交獲得bc8f1，將其命名為cms-sgz900，經育性鑒定為不育材料，表現型為抗病性強、長勢優良的高花色苷含量的小菘菜不育材料。

一種小菘菜細胞質雄性不育系及保持系的繁殖方法，具體繁殖步驟如下：

以cms-sgz900為母本，sgz901為父本，以網罩擴繁的方式進行雜交，cms-sgz900收獲的種子為不育胞質為haucms的小菘菜不育系a-sgz900，sgz901收獲的種子為小菘菜的保持系b-sgz901。

本發明的有益效果是：菘菜細胞質雄性不育系的不育性非常穩定和徹底，該不育系不受溫度和光照條件影響，在中國韶關（短日照）和甘肅和政（長日照）的育性鑒定表明，其育性均表現0級，不育株率及不育度均為100%；小菘菜細胞質雄性不育系沒有任何死蕾和苗期黃化現象；選育出的不育系及保持系抗病性好，長勢優良；該不育系花色苷含量高，同時以該不育系為親本選配的雜交后代均表現為高花色苷含量的后代。

附圖說明

圖1是本發明選育繁殖示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。

參見圖1，一種小菘菜細胞質雄性不育系及保持系的選育及繁殖方法，它以6-1029及紫332為高花色苷基因供體，以大白菜細胞質雄性不育系cms63-5為不育胞質基因供體，以小菘菜自交系sg900及sg901為父本材料，通過雜交、多代連續回交，結合栽培試驗、抗性鑒定、花色苷含量篩選及育性鑒定得到了遺傳穩定、抗病性強、生長性狀優良的小菘菜高花色苷含量的細胞質雄性不育材料cms-sgz900，以cms-sgz900為母本，sgz901為父本雜交，得到了小菘菜不育系a-sgz900及其保持系b-sgz901。具體選育步驟如下：

一、花色苷供體的花色苷含量及組分測定

1、花色苷含量測定

于5葉期分別取6-1029及紫332大三葉，采用分光光度法（fulekit,francisfj.quantitativemethodsforanthocyanins[j].journaloffoodscience,1968,33(3):266-274.）測定兩者花色苷含量，結果顯示：6-1029花色苷含量為62.55mg/100g；紫332花色苷含量為133.26mg/100g。

2、花色苷組分測定

將步驟1中提取的花色苷，采用hplc-ms方法（derossovv,hillebrands,montillaec,etal.determinationofanthocyaninsfromacerola(malpighiaemarginatadc.)anda?ai(euterpeoleraceamart.)byhplc–pda–ms/ms[j].journaloffoodcompositionandanalysis,2008,21(4):291-299.）進行組分分析。最終確定6-1029中花色苷組分為：飛燕草素-3-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-雙葡萄糖苷、矮牽牛素-3-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、飛燕草素-3-雙葡萄糖苷、飛燕草素-3-三葡萄糖苷、矮牽牛素-3-三葡萄糖苷；紫332花色苷組分為：矮牽牛素-3-雙葡萄糖苷、矮牽牛素-3-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-雙葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-葡萄糖苷、矮牽牛素-5-葡萄糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、飛燕草素-3-三葡萄糖苷、飛燕草素-3-雙葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-三葡萄糖苷等。

根據1、2中結果確定6-1029及紫332主要成分為花色苷，同時其組成成分不同，從而確定控制6-1029及紫332花色苷合成的基因為不同基因。

二、父本選育及自交親和性檢測

以莎麗母本，蕾用菜為父本，采用撥蕾雜交授粉，對雜交后代進行抗病性及產量鑒定，對耐抽薹單株進行撥蕾自交，連續自交5代后選育出sg900品系；以阿美為母本，晴美為父本，雜交后代結合抗病性鑒定及產量鑒定，對耐抽薹單株進行撥蕾自交，連續自交5代后選出sg901品系。

將sg900及sg901進行正反交，鑒定雜交組合的結實情況，結果發現結實正常。

三、高花色苷中間親本選育

1、高花色苷含量的中間親本1的轉育

以6-1029為母本，sg901為父本，采用人工撥蕾去雄雜交的方式授粉得到f1；種植f1群體，采用分光光度法于5葉期對f1群體進行高花色苷含量單株進行篩選，以含量最高單株為母本、sg901為父本，采用人工撥蕾去雄雜交的方式進行雜交，得到（6-1029×sg901）bc1f1。

種植（6-1029×sg901）bc1f1群體，于5葉期采用分光光度法對該群體進行高花色苷含量單株篩選，以含量最高單株為母本，sg901為父本，采用撥蕾去雄雜交的方法得到（6-1029×sg901）bc2f1。

重復上述步驟，以雜交后代中花色苷含量最高單株為母本，sg901為父本，共回交8代，得到（6-1029×sg901）bc8f1，將其編號為sgz901。

2、高花色苷含量的中間親本2的轉育

以紫332為母本，sg900為父本，采用人工撥蕾方式雜交授粉，得到雜交后代（紫332×sg900）f1；種植（紫332×sg900）f1，于5葉期采用分光光度法對該群體進行高花色苷含量單株篩選，將含量最高單株自交得到（紫332×sg900）f2；種植（紫332×sg900）f2群體，于5葉期采用分光光度法進行高花色苷含量單株篩選，選擇（紫332×sg900）f2中花色苷含量最高為母本、sg900為父本，采用撥蕾去雄方式進行雜交，得到（紫332×sg900）bc1f1；種植（紫332×sg900）bc1f1群體，重復上述花色苷高含量單株篩選步驟，將花色苷含量最高單株為母本，sg900為輪回親本，回交6代，得到（紫332×sg900）bc6f1；種植（紫332×sg900）bc6f1群體后，篩選花色苷含量最高單株，將其自交得到（紫332×sg900）bc6f2，其編號為sgz900。

四、不育材料的選育

以cms63-5為母本，sgz900為父本，5葉期對sgz900群體進行高花色苷含量單株篩選，同時對sgz900及cms63-5進行抗病性及生育期的育性鑒定，選擇cms63-5中抗病性強、不育單株為母本，sgz900中抗病性強、可育及花色苷含量最高單株為父本，采用撥蕾授粉的方式進行雜交一代的選育，得到（cms63-5×sgz900）f1；

種植（cms63-5×sgz900）f1群體，于5葉期進行高花色苷含量單株篩選，以花色苷含量最高的不育單株為母本，以sgz900中花色苷含量最高、抗病性強的單株為父本，撥蕾雜交得到（cms63-5×sgz900）bc1f1；

種植（cms63-5×sgz900）bc1f1群體，重復上一步驟，以雜交后代中花色苷含量最高的不育單株為母本，以sgz900中花色苷含量最高、抗病性最強的單株為父本，采用撥蕾授粉方式雜交得到（cms63-5×sgz900）bc2f1。

選擇雜交后代群體進行花色苷含量檢測，選擇花色苷含量最高單株作為非輪回親本（母本）；對sgz900進行花色苷含量檢測及抗病性鑒定，選擇花色苷含量最高、抗病性強單株為輪回親本（父本）；通過撥蕾授粉方式共回交8次，得到（cms63-5×sgz900）bc8f1，將其編號命名為：cms-sgz900。

五、小菘菜不育系及保持系的繁殖

將cms-sgz900群體及sgz901群體按照4:2行數種植。cms-sgz900群體，于5葉期進行花色苷含量檢測，去除花色苷含量低的單株；于花期進行育性鑒定，發現該群體完全不育，不育度100%。sgz901群體，于5葉期進行花色苷含量檢測，去除花色苷含量低的單株；進行抗病性鑒定，剔除抗病性弱的單株；花期進行育性鑒定，發現該群體完全可育。以cms-sgz900為母本，sgz901為父本，以網罩擴繁的方式進行雜交。

分別收獲cms-sgz900及sgz901種子，第二年分別進行抗病性鑒定、長勢測定、育性鑒定及花色苷含量測定，cms-sgz900所收獲的種子全部為不育單株，為本發明中的不育系，編號為a-sgz900，sgz901上收獲種子為本發明中的保持系，編號為b-sgz901。