本發明涉及煙草品種青枯病抗性的鑒定方法。
背景技術：
：煙草是我國乃至全球的重要經濟作物。由青枯勞爾氏菌(ralstoniasolanacearum)引起的煙草青枯病是煙草主要病害之一，常年造成的產量損失在20％左右，重者可達50％，甚至絕收，嚴重影響了煙葉的產量和品質。煙草青枯病的侵染源主要有帶菌土壤、病殘體，病原菌從煙草的傷口侵入。近年來由于煙草連作，青枯病等土傳病害的發生程度和面積逐年上升。目前，生產上防治青枯病主要采取化學防治方法。但長期大量施用化學農藥既容易使病菌產生抗藥性，又容易造成嚴重的環境污染。如，閆芳芳等(2013年)報道采用在土壤中添加石灰和t-310可以減輕青枯病的發生，但t-310配料較為復雜且來源受限，石灰用量也必須嚴格控制，否則極易造成土壤板結。生產實踐證明，選育和種植抗病品種是防治煙草青枯病最為經濟、有效、安全的措施。而煙草品種的抗病性鑒定是選育抗病品種必不可少的關鍵技術：準確鑒定不同煙草品種的抗病性，有助于更好地利用現有煙草品種，更快速、準確的篩選出抗源材料，進而選育出優良的抗病品種。作物病害的品種抗性鑒定評價方法有自然感病鑒定和人工接種鑒定兩種。自然感病鑒定具有操作簡便的優點，但受環境因素影響大、發病不均勻、鑒定所需時間長；人工接種鑒定以其方法標準、發病快速、鑒定時間短、鑒定結果準確等特點，被育種者和植保工作者廣泛采用。但現有的煙草青枯病人工接種鑒定方法，煙苗需在ms培養基培育，且在鑒定前，需將煙苗進行逐株剪刀傷根，接種后還需滅菌濾紙吸干多余菌液，并需將煙苗重新栽回培養基中。其鑒定成本仍然偏高、鑒定條件苛刻，難以大規模推廣應用。技術實現要素：本發明的目的是提供一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，該方法操作簡便、易于掌握、鑒定快速、結果更準確；可為抗病材料篩選和抗病品種選育提供更好的技術支撐。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是，一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即在25～28℃的溫度下、用ttc培養基培養3-5天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由8-12份重的蛋白胨、0.8-1.2份重的水解乳蛋白、7-13份重的葡萄糖、15-20份重的瓊脂、45-55份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在25～28℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾水得到青枯菌濃度為1.5×108cfu/ml～2×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由2.5-3份重的牛肉浸膏、4-6份重的蛋白胨、210-220份重的葡萄糖、14-18份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到3～4片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射2～4ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為28～30℃、相對濕度大于80％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表，鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。與現有技術相比，本發明的有益效果是：一、侵染效果好、發病充分：利用注射器進行針刺接種，既能造成病菌入侵的傷口，又能確保病菌能進入植株體內，且對植株傷害小，從而保證浸染效果，發病迅速、充分。二、鑒定結果準確可靠：試驗煙苗選擇的是在營養缽內培育到3～4片真葉的煙苗，煙苗大小和長勢一致，且傷口采用的是逐株相同部位針刺、逐株注射進行接種，從而達到傷口程度和接菌量一致，確保了接菌后發病均勻，保證了鑒定結果的準確性和一致性。三、操作簡便、易于掌握：煙苗的培育選擇在營養缽內常規進行，煙苗的接菌侵染采用注射器，接種病原菌后的煙苗放入日光溫室培育，整個過程均不需特殊設施設備，也不需特別工藝，操作簡便、易于掌握。四、可進行大量材料的鑒定篩選：由于煙苗的培育選擇在營養缽內進行，接種后的煙苗放入日光溫室培育，占地面積小，且工序簡單，適宜進行大量材料的鑒定篩選。測定試驗證明，本發明方法的測定結果準確、誤差小，重復性及一致性好：對已知青枯病抗性分別為中抗和高感的云煙87、紅花大金元2個品種，采用本發明方法進行測定，測出的病情指數分別為28.97～39.73和48.44～89.67，確定出其青枯病抗性分別為中抗和高感，鑒定結果與兩個品種的已知抗性完全一致。下面結合具體實施方式對本發明作進一步的詳細說明。具體實施方式實施例一一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即在25℃的溫度下、用ttc培養基培養3天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由12份重的蛋白胨、0.8份重的水解乳蛋白、13份重的葡萄糖、20份重的瓊脂、55份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在25℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾培養水得到青枯菌濃度為1.5×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由2.5份重的牛肉浸膏、6份重的蛋白胨、210份重的葡萄糖、14份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到4片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射4ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為28℃、相對濕度為81％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。用本例方法對煙草品種—紅花大金元進行青枯病抗性鑒定，得出供試的紅花大金元煙苗的病情指數為81.67，鑒定出其青枯病抗性為高感；與該品種的已知抗病性一致。實施例二一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即在28℃的溫度下、培養5天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由8份重的蛋白胨、1.2份重的水解乳蛋白、7份重的葡萄糖、15份重的瓊脂、45份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在26℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾水得到青枯菌濃度為2×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由3份重的牛肉浸膏、4份重的蛋白胨、220份重的葡萄糖、18份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到3片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射2ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為30℃、相對濕度為85％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。用本例方法對煙草品種—紅花大金元進行青枯病抗性鑒定，得出紅花大金元煙苗的病情指數為88.63，鑒定出其青枯病抗性為高感；與該品種的已知抗病性一致。實施例三一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即在27℃的溫度下、用ttc培養基培養4天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由10份重的蛋白胨、1.0份重的水解乳蛋白、10份重的葡萄糖、18份重的瓊脂、50份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在26℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾水得到青枯菌濃度為1.7×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由2.8份重的牛肉浸膏、5份重的蛋白胨、215份重的葡萄糖、16份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到3片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射3ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為29℃、相對濕度為90％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。用本例方法對煙草品種—紅花大金元進行青枯病抗性鑒定，得出供試紅花大金元煙苗的病情指數為84.41，鑒定出其青枯病抗性為高感；與該品種的已知抗病性一致。實施例四一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即在25℃的溫度下、用ttc培養基培養3天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由8份重的蛋白胨、0.8份重的水解乳蛋白、7份重的葡萄糖、15份重的瓊脂、45份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在28℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾水得到青枯菌濃度為2×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由2.5份重的牛肉浸膏、4份重的蛋白胨、210份重的葡萄糖、14份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到3片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射4ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為28℃、相對濕度為82％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。用本例方法對煙草品種—云煙87進行青枯病抗性鑒定，得出云煙87煙苗的病情指數為39.73鑒定出其青枯病抗性為中抗；與該品種已知的青枯病抗性一致。實施例五一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即-在28℃的溫度下、培養5天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由12份重的蛋白胨、1.2份重的水解乳蛋白、13份重的葡萄糖、20份重的瓊脂、55份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在27℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾水得到青枯菌濃度為1.5×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由3份重的牛肉浸膏、6份重的蛋白胨、220份重的葡萄糖、18份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到4片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射2ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為30℃、相對濕度大于95％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。用本例方法對煙草品種—云煙87進行青枯病抗性鑒定，得出云煙87煙苗的病情指數為38.22，鑒定出云煙87的青枯病抗性為中抗，與該品種的青枯病已知抗性一致。實施例六一種苗期快速鑒定煙草品種青枯病抗性的方法，其步驟為：a、供試煙苗培育：在營養缽內按漂浮育苗方法對供試煙草品種進行煙苗的培育，育苗過程中不使用殺菌劑；b、青枯病接種體的制備：將從田間采集到的煙草青枯病病株，采用ttc培養基進行分離純化培養，即在27℃的溫度下、培養4天，得到純化培養的青枯菌；所述的ttc培養基由9份重的蛋白胨、1.1份重的水解乳蛋白、11份重的葡萄糖、17份重的瓊脂、51份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸餾水配制而成；將ttc培養基中純化培養的青枯菌，接種在na培養基上，在27℃的溫度下，振蕩培養12h；再加入蒸餾水得到青枯菌濃度為1.8×108cfu/ml的接種菌液；所述的na培養基由2.7份重的牛肉浸膏、5份重的蛋白胨、216份重的葡萄糖、17份重的瓊脂、1000份重的蒸餾水配制而成；c、青枯病接種：用注射器吸取b步得到的接種菌液，選取a步營養缽內長到3片真葉的煙苗，在選取的每株煙苗的葉腋處往莖桿斜插注射3ul接種菌液；(4)青枯病的培養及發病情況調查：將c步接種后的煙苗放在日光培養室內培養10天，培養時的溫度為29℃、相對濕度大于80％；在培養的第10天，觀察記載煙苗的發病情況；并按照國家標準《煙草病蟲害分級及調查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出煙苗的病情指數；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指數00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根據煙苗的病情指數和上表鑒定出供試煙草品種的青枯病抗性。用本例方法對煙草品種—云煙87進行青枯病抗性鑒定，得出云煙87煙苗的病情指數為39.33，鑒定出云煙87的青枯病抗性為中抗，與該品種的青枯病已知抗性一致。當前第1頁12