一種花生白絹病溫室苗期接種方法與流程

本發明涉及一種花生白絹病溫室苗期接種方法。

背景技術：

花生白絹病，又稱白腳病，是由半知菌亞門無孢菌目齊整小菌核屬(sclerotiumrolfsiisacc.)引起的一種土傳維管束病害，花生白絹病在我國長江流域以南的省份發生廣泛，在北方花生產區零星發生。近年來隨全球氣候的變暖，高水肥高密度種植模式下花生冠層郁閉的小環境導致白絹病在我國危害愈來愈嚴重，發生區域從南方蔓延到北方，造成了嚴重的經濟損失。2004年山東臨沂發病面積達6萬公頃，占全市播種面積的40％，重病田病株率達到67.3％。2007年河南鄭州東部重病田發病率達20％；同年該病害在遼寧興城首次大面積發生，一般地塊發病株率為10％左右，嚴重地塊發病株率為30％～40％。由于花生白絹病以菌核在病殘體和土層中越冬，能在土壤中存活多年，防治比較困難。

目前針對該病害的防治措施主要包括與非寄主作物的輪作、深耕，這些栽培措施防治效果不理想；利用殺菌劑防治花生白絹病具有一定的防治效果，但殺菌劑防治存在高成本、破壞環境及導致病原產生抗藥性等問題。目前在國家提倡的“減施化肥和農藥”的方針下，急需建立經濟有效的防治措施。防治花生白絹病最經濟有效的防治方法是種植抗病品種，我國目前尚無高抗品種的報道，而篩選抗病品種必須建立穩定可靠的抗性鑒定技術。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種花生白絹病溫室苗期接種方法，旨建立一種簡便、可靠的白絹菌接種方法，便于苗期篩選抗白絹病的花生種質，獲得抗白絹病的材料，為抗病育種提供技術手段。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：一種花生白絹病溫室苗期接種方法，其特征在于包括如下步驟：

1)白絹菌株的獲得(分離獲得白絹病菌)：從田間(武漢市的田間)花生白絹病株上采集白絹菌核，在室內進行分離、純化{表面消毒后接種pda培養基，30℃恒溫培養后，挑取菌落菌絲尖端轉接新鮮pda培養基}，鑒定{收集菌絲提取dna，然后利用真菌dnaits區間通用引物its1和its4pcr擴增后序列測定，經blast在genbank比對，鑒定為sclerotiumrolfsii}；獲得白絹病菌(sclerotiumrolfsii)菌株(或稱武漢菌株)；

2)帶菌接種物的制備：白絹菌的活化：將4℃保存白絹病菌菌株(或稱白絹病菌武漢菌株)的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸鈉浸泡2min，無菌蒸餾水沖洗3次，蘸干后接種于pda培養基上，30℃黑暗條件下培養至菌絲長出，得到活化的白絹菌絲；

①白絹菌碟的制備：取活化的白絹菌絲接種于pda培養上，30℃黑暗條件下培養3～4d，利用0.5cm的滅菌打孔器在菌落邊緣菌絲處打孔(無菌打孔器打取菌碟)，獲得白絹菌碟；

②帶菌牙簽的制備：滅菌牙簽呈扇形插入中央放置白絹菌碟的pda培養中，培養至牙簽布滿菌絲，得到帶菌牙簽；

具體為：將牙簽用蒸餾水浸泡過夜后，控干水分，高溫高壓滅菌后，超凈工作臺中呈扇形排布于pda平板上，中央接種新鮮的白絹菌碟，30℃黑暗條件下培養5～6d，直至菌絲布滿牙簽；

③帶菌燕麥粒的制備：燕麥粒用水浸泡后高壓滅菌，冷卻后接種白絹菌碟，培養至燕麥粒上布滿菌絲，每天搖動培養瓶，確保燕麥粒均有菌絲生長，得到帶菌燕麥粒；

具體為：將燕麥粒裝入三角瓶中，蒸餾水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高壓滅菌20min；將白絹菌碟接種到滅菌的燕麥粒中，置于30℃黑暗條件下培養5～6d，每天搖動接種瓶2-3次，直至所有燕麥粒均有菌絲生長；

3)帶菌接種物以不同方式接種花生幼苗：通過不同白絹菌的接種物接種花生幼苗，所述接種物為白絹菌碟、帶菌牙簽或帶菌燕麥粒，不同時間觀察癥狀表現，明確帶菌燕麥粒接種優于白絹菌碟和帶菌牙簽，其中帶菌燕麥粒貼莖法病害發展速度最快，其次為帶菌燕麥粒撒表土法，這兩種方法病情指數差異不顯著，其中帶菌燕麥粒撒表土法比貼莖法操作簡便、快速，選擇該方法為花生白絹病接種方法；

具體為：將感病花生(感病花生品系14-2012)種植于溫室的塑料大盆中，土壤：蛭石：營養土的質量比＝2：1：1，培養溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生單粒種植，行距12～13cm，間距為6～9cm；播種15d后的花生幼苗按照下面5種方法接種白絹病菌：①菌碟法：將白絹菌碟(簡稱菌碟)的菌絲面貼在花生植株莖基部，透明膠固定；②牙簽法：將帶菌牙簽(長滿菌絲的牙簽)插入距離莖基部周圍的土壤中，5根帶菌牙簽/植株(每植株插入5根帶菌牙簽)；③燕麥粒貼莖法：將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)按照每株2粒，貼于花生莖基部，并纏繞透明膠固定；④燕麥粒埋土法：將帶菌燕麥粒埋入花生莖基部周圍2cm深的土層中，2粒/株(每株埋入2粒帶菌燕麥粒)；⑤燕麥粒撒表土法：花生植株澆透水分，將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)撒在植株莖基部周圍的土壤表面，2粒/株(每株根表撒布2粒帶菌燕麥粒)，每天澆水一次；

5種方法接種白絹病菌，每種處理4次重復，每種重復7～10株，隨機排列；從接種4d后開始調查植株發病，隨后間隔3d調查一次，一共調查7次，記錄發病株數和發病的嚴重度；試驗重復兩次；病害分級的調查根據shokes等1998的標準稍加修改：1級：僅莖上有病斑，2級：莖基部有病斑，全株≤25％以下萎蔫和死亡，3級：全株26-50％表現萎蔫和死亡，4級：全株≥50％表現萎蔫和死亡。

病情指數的計算公式為：di＝{[σ(各級病株×相對級數值)]/(調查總株數×4)}×100；

4)不同數量的帶菌燕麥粒接種花生幼苗：播種15d的花生幼苗澆水后，將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于花生莖基部周圍，接種量分別為1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每個處理4次重復(處理指不同接種數量，就是接種1粒～5粒這5個不同處理)，每個重復7～10株，隨機排列；每天澆水一次，溫室培養條件同上(培養溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗)；接種4d后開始病害調查，間隔3d調查一次，調查4周；試驗重復2次；

5)帶菌燕麥粒接種不同苗齡的花生幼苗：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株莖基部周圍，接種量為4粒/植株，7～10株/重復，每個處理四次重復，隨機排列，接種后管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開始病害調查，間隔3d調查一次，調查4周；試驗重復2次；

6)帶菌燕麥粒接種不同花生品種/系：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d的19份品種/品系花生幼苗莖基部周圍，4粒/植株，7～10植株/重復，每個處理四次重復，隨機排列，接種后的管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開始病害調查，間隔3d調查一次，調查4周；試驗重復2次。

本發明主要通過分離獲得白絹菌；通過不同接種技術的比較，獲得較好的接種方式；并對接種量和接種時間的比較，明確最佳的接種量和接種時間；進一步對不同花生品種/系接種進行抗病性鑒定，獲得相對抗病的花生材料。為花生抗白絹病種質資源的篩選和培育抗白絹病品種提供技術支撐。

本發明的有益效果是：本發明的方法繁殖的白絹菌的致病性強，接種操作簡單，不需要額外蓋膜保濕，受環境影響小，效果穩定，接種效率高，可結合田間接種實驗，輔助驗證花生種質對花生白絹病的抗性。本發明提供一種簡便、快速、可靠的花生抗白絹病的鑒定方法，可以進行大量花生種質資源材料抗白絹病的鑒定，為花生抗白絹病種質資源的篩選和培育抗白絹病品種提供技術支撐。

附圖說明

圖1是花生白絹菌的菌落形態圖(純化的白絹菌在pda培養基上的菌落)。

圖2是不同接種方法接種花生后的病害發展動態圖。

圖2中：橫向座標標號，1-接種后第4天，2-接種后第7天，3-接種后第10天，4-接種后第13天，5-接種后第16天，6-接種后第19天，7-接種后第22天。

圖3是不同花生品種/系接種白絹后的表現圖(即白絹菌接種不同品種/系花生幼苗后的癥狀)。

圖3中：從左至右，1、2、3、4、5縱向排為不同花生品種/系。

具體實施方式

一種花生白絹病溫室苗期接種方法，包括如下步驟：

1).白絹菌株的獲得(分離獲得白絹病菌)：從武漢的田間花生白絹病株上采集白絹菌核，在室內進行分離、純化{表面消毒后接種pda培養基，30℃恒溫培養后，挑取菌落菌絲尖端轉接新鮮pda培養基}，鑒定{收集菌絲提取dna，然后利用真菌dnaits區間通用引物its1和its4pcr擴增后序列測定，經blast在genbank比對，鑒定為sclerotiumrolfsii}；獲得白絹病菌(sclerotiumrolfsii)菌株；

2).帶菌接種物的制備：白絹菌的活化：將4℃保存白絹病菌菌株(白絹病菌武漢菌株)的菌核利用70wt％乙醇表面消毒30s，1wt％次氯酸鈉浸泡2min，無菌蒸餾水沖洗3次，蘸干后接種于pda培養基上，30℃黑暗條件下培養至菌絲長出，得到活化的白絹菌絲；

①白絹菌碟的制備：取活化的白絹菌絲接種于pda培養上，30℃黑暗條件下培養3～4d，利用0.5cm的滅菌打孔器在菌落邊緣菌絲處打孔(無菌打孔器打取菌碟)，獲得白絹菌碟；

②帶菌牙簽的制備：滅菌牙簽呈扇形插入中央放置白絹菌碟的pda培養中，培養至牙簽布滿菌絲，得到帶菌牙簽；

具體為：將牙簽用蒸餾水浸泡過夜后，控干水分，高溫高壓滅菌后，超凈工作臺中呈扇形排布于pda平板上，中央接種新鮮的白絹菌碟，30℃黑暗條件下培養5～6d，直至菌絲布滿牙簽；

③帶菌燕麥粒的制備：燕麥粒用水浸泡后高壓滅菌，冷卻后接種白絹菌碟，培養至燕麥粒上布滿菌絲，每天搖動培養瓶，確保燕麥粒均有菌絲生長，得到帶菌燕麥粒；

具體為：將燕麥粒裝入三角瓶中，蒸餾水浸泡4h后，倒掉水分，121℃高壓滅菌20min；將白絹菌碟接種到滅菌的燕麥粒中，置于30℃黑暗條件下培養5～6d，每天搖動接種瓶2-3次，直至所有燕麥粒均有菌絲生長；

3).帶菌接種物以不同方式接種花生幼苗：通過不同白絹菌的接種物接種花生幼苗，所述接種物為白絹菌碟、帶菌牙簽或帶菌燕麥粒，不同時間觀察癥狀表現，明確帶菌燕麥粒接種優于白絹菌碟和帶菌牙簽，其中帶菌燕麥粒貼莖法病害發展速度最快，其次為帶菌燕麥粒撒表土法，這兩種方法病情指數差異不顯著，其中帶菌燕麥粒撒表土法比貼莖法操作簡便、快速，選擇該方法為花生白絹病接種方法；

具體為：將感病花生(感病花生品系14-2012)種植于溫室的塑料大盆中，土壤：蛭石：營養土的質量比＝2：1：1，培養溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗，感病花生單粒種植，行距12～13cm，間距為6～9cm；播種15d后的花生幼苗按照下面5種方法接種白絹病菌：①菌碟法：將白絹菌碟(簡稱菌碟)的菌絲面貼在花生植株莖基部，透明膠固定；②牙簽法：將帶菌牙簽(長滿菌絲的牙簽)插入距離莖基部周圍的土壤中，5根帶菌牙簽/植株(每植株插入5根帶菌牙簽)；③燕麥粒貼莖法：將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)按照每株2粒，貼于花生莖基部，并纏繞透明膠固定；④燕麥粒埋土法：將帶菌燕麥粒埋入花生莖基部周圍2cm深的土層中，2粒/株(每株埋入2粒帶菌燕麥粒)；⑤燕麥粒撒表土法：花生植株澆透水分，將帶菌燕麥粒(帶菌的燕麥粒)撒在植株莖基部周圍的土壤表面，2粒/株(每株根表撒布2粒帶菌燕麥粒)，每天澆水一次；

5種方法接種白絹病菌，每種處理4次重復，每種重復7～10株，隨機排列；從接種4d后開始調查植株發病，隨后間隔3d調查一次，一共調查7次，記錄發病株數和發病的嚴重度；試驗重復兩次；病害分級的調查根據shokes等1998的標準稍加修改：1級：僅莖上有病斑，2級：≤25％的莖萎蔫和死亡，3級：26-50％莖萎蔫和死亡，4級：≥50％的莖萎蔫和死亡；

病情指數的計算公式為：di＝{[σ(各級病株×相對級數值)]/(調查總株數×4)}×100；

4).不同數量的帶菌燕麥粒接種花生幼苗：播種15d的花生幼苗澆水后，將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于花生莖基部周圍，接種量分別為1粒、2粒、3粒、4粒和5粒；每個處理4次重復(處理指不同接種數量，就是接種1粒～5粒這5個不同處理)，每個重復7～10株，隨機排列；每天澆水一次，溫室培養條件同上(培養溫度為26±1℃，16h光照/8h黑暗)；接種4d后開始病害調查，間隔3d調查一次，調查4周；試驗重復2次；

5).帶菌燕麥粒接種不同苗齡的花生幼苗：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d、20d、25d、30d和35d的花生植株莖基部周圍，接種量為4粒/植株，7～10株/重復，每個處理四次重復，隨機排列，接種后管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開始病害調查，間隔3d調查一次，調查4周；試驗重復2次；

6).帶菌燕麥粒接種不同花生品種/系：將帶菌燕麥粒利用撒表土法接種于播種后15d的19份品種/品系花生幼苗莖基部周圍，4粒/植株，7～10植株/重復，每個處理四次重復，隨機排列，接種后的管理方法同上(每天澆水一次)；接種4d后開始病害調查，間隔3d調查一次，調查4周；試驗重復2次。采用相對抗病程度評價方法(王繼華等2005，鄭章云等2015)調查供試花生品種/系對花生白絹病的溫室苗期抗病能力。相對病情指數(relativediseaseindex,rdi)＝1-鑒定品種平均病情指數/發病最嚴重品種的平均病情指數。抗病程度分為5級，免疫：相對抗病指數為1.0，高抗：相對抗病指數為0.8～0.99，抗病：相對抗病指數為0.40～0.79，中感：相對抗病指數為0.2～0.39，高感：相對抗病指數低于0.2。

1～5粒帶菌燕麥粒通過撒表土法接種花生，發現不同接種量間病情指數差異不顯著，其中以接種4粒帶菌燕麥的發病率和病情指數最高；利用帶菌燕麥粒接種不同苗齡的花生植株，發現播種后15d～35d的花生幼苗接種白絹菌都能發病，病情指數方差分析無顯著差異，以播種后15d接種白絹菌和病害調查時間總共所用的時間少，單位時間內鑒定的材料份數多，選擇該時間為白絹病的接種時間；建立了花生播種后15d的幼苗以4粒帶菌燕麥粒撒于莖基部土表的花生白絹接種方法。

花生抗白絹病的評價：19份花生材料利用帶菌燕麥粒接種花生，通過不同時間的癥狀觀察，統計發病率和病情指數，發現絕大部分材料為感病材料，只有1份材料存在相對抗性。

表15種不同接種方法接種3周后的發病結果

表1中：方差分析p<0.05時，相同小寫字母表示兩個處理間平均數差異不顯著，不同字母表示兩個處理間平均數差異顯著(即a，b，c)。

表2帶菌燕麥粒不同接種量接種后3周后的發病結果

表2中：方差分析p<0.05時，相同小寫字母表示處理間平均數差異不顯著。

表3不同苗齡接種帶菌燕麥粒的發病結果

表3中：方差分析p<0.05時，相同小寫字母表示兩個處理間平均數差異不顯著。

表4不同花生品種/系接種白絹菌后的抗/感病表現

表4中：hs表示高度敏感，ms表示中等敏感，mr表示中等抗性。