春雷霉素及其衍生物為幾丁質酶抑制劑的應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種真菌次級代謝產物及其衍生物作為幾丁質酶的抑制劑的應用。

背景技術：

幾丁質(chitin)是以n-乙酰-β-d-葡萄糖胺(glcnac)為基本單元，通過β-1,4糖苷鍵連接的天然線性直鏈多糖。作為重要的結構組成部分，幾丁質大量存在于真菌和硅藻的細胞壁、軟體動物的外殼、線蟲的卵殼以及甲殼類生物和昆蟲的外骨骼中，其合成和水解的動態平衡對于這些生物的生長發育具有極其重要的作用。來自糖基水解酶18家族的昆蟲幾丁質酶chti(chitinasei)是昆蟲蛻皮和變態發育中不可或缺的幾丁質水解酶。下調或干擾chti基因表達水平將導致昆蟲蛻皮不正常而死亡。chti在生理功能上是特異的表皮幾丁質降解酶，功能區別于人類的同源酶，因此，將18家族幾丁質酶作為農藥設計的靶點，開發高效的幾丁質酶抑制劑對于農業害蟲的防治具有非常重要的意義。近十年來，昆蟲chti的研究在生物學和化學生物學等領域取得了突出進展。其中，來源于農業害蟲亞洲玉米螟—chti(ofchti)的晶體結構的解析取得重要進展，為針對chti的農用小分子理性設計提供理論基礎。

春雷霉素(kasugamycin)由春日鏈霉菌(streptomyceskasugaensis)所產生，屬氨基糖苷類抗生素。春雷霉素在亞洲和南美洲被廣泛應用于農業，對水稻稻瘟病(包括葉瘟、稻頭瘟、谷瘟)等的防治尤為顯著，一般可達到80％以上。不僅如此，春雷霉素的適用作物還包括馬鈴薯、黃瓜、芹菜、高粱、辣椒、菜豆、柑橘等，可防治甜菜上的甜菜生尾孢、馬鈴薯上的胡蘿卜軟鷗文氏菌、菜豆上的棲菜豆假單孢菌、黃瓜上的流淚假單孢菌、番茄葉霉病、黃瓜細菌性角斑病等。另外因春雷霉素對人畜無毒、無殘留、無污染，符合現代環保要求，被中國綠色食品發展中心推薦為aa級綠色食品生產資料，被農業部列為無公害農產品生產推薦農藥，被上海市列為蔬菜標準化工程首推殺菌劑。以其為基礎開發新的藥學用途可以大大節約研發周期和成本,“老藥新用”被認為是新藥開發中最快捷、最有效的策略之一。春雷霉素及其衍生物針對18家族糖基水解酶的生物活性還沒有報導，因此，研究春雷霉素作為18家族糖基水解酶抑制劑對于擴展其應用有非常積極的意義。

技術實現要素：

在防治農業害蟲的研究中，為了找到高效的18家族糖基水解酶抑制劑，本發明篩選了大量的化合物，通過抑制效果、選擇性和殺蟲活性評價對化合物的抑制活性進行了抑制效果評價研究，最終篩選到了春雷霉素及其衍生物。

首先，本發明公開春雷霉素及其衍生物作為幾丁質酶抑制劑的應用，其結構通式如i所示，即春雷霉素及其衍生物。

r1基團選自以下取代基：

r2基團選自以下取代基：

本發明還公開結構通式如i所示的抑制劑和/或其衍生物在抑制18家族幾丁質酶活性中的應用。具體的，所述抑制劑和/或其衍生物在抑制18家族幾丁質酶活性中使用的終濃度為50μm。

本發明還公開所述的抑制劑在防治農業害蟲方面的應用。

具體的所述的農業害蟲是鱗翅目昆蟲，包括麥蛾、棉紅鈴蟲、馬鈴薯塊莖蛾、甘薯麥蛾、棉褐帶卷蛾、大豆食心蟲、梨大食心蟲、亞洲玉米螟、大造橋蟲、菜粉蝶、棉鈴蟲、舞毒蛾、玉帶風蝶、金鳳蝶、舟形毛蟲、黃腹燈蛾、紅腹燈蛾、美國白蛾、葡萄天蛾和稻苞蟲等。

本發明提供了評價結構通式如i所示的化合物(kasugamycin)抑制活性所獲得的數據，包括抑制劑篩選、ic50值測定和選擇性測定所獲得的數據。結果表明，在篩選的所有556個微生物次級代謝產物中，化合物kasugamycin(終濃度50μm)對幾丁質酶ofchti的抑制率為86.4％，ic50值為14μm。對化合物的適用對象測定表明，在50μm終濃度下，化合物kasugamycin對幾丁質酶ofchti表現出較高的抑制活性，對于其他來源的幾丁質酶(除了粘質沙雷氏菌來源的smchib、smchic之外)也同樣表現出一定的抑制活性。綜上，化合物kasugamycin針對不同物種來源的幾丁質酶均能表現出抑制活性，同時根據ic50值可以推斷，當化合物kasugamycin的濃度≥20μm時，對幾丁質酶ofchti有較強抑制活性。

本發明化合物殺蟲活性的方法為：用h2o作為溶劑溶解化合物，采用注射方式直接將化合物導入研究對象體內。經過研究化合物kasugamycin在50μm濃度下對亞洲玉米螟的殺蟲活性可以發現，相較于對照組，實驗組幼蟲的發育被延緩。

由本發明實施例3的體內試驗數據證明，春雷霉素及其衍生物在防治農業害蟲方面有良好的應用前景。尤其是在延緩亞洲玉米螟發育方面有較好的效果；優選情況下，所述的農業害蟲是鱗翅目昆蟲。具體的，所述的鱗翅目昆蟲為麥蛾、棉紅鈴蟲、馬鈴薯塊莖蛾、甘薯麥蛾、棉褐帶卷蛾、大豆食心蟲、梨大食心蟲、亞洲玉米螟、大造橋蟲、菜粉蝶、棉鈴蟲、舞毒蛾、玉帶風蝶、金鳳蝶、舟形毛蟲、黃腹燈蛾、紅腹燈蛾、美國白蛾、葡萄天蛾或稻苞蟲。

附圖說明

圖1為化合物kasugamycin對ofchti的ic50值測定示意圖。其中橫坐標log[kasugamycinconc(μm)]表示以10為底的化合物濃度對數值，濃度單位為μm；縱坐標inhibitionrate表示抑制率；圖中曲線對應不同的底物濃度下，inhibitionrate隨化合物濃度的變化而變化的趨勢，曲線上縱坐標為0.5的點所對應的橫坐標數值即為化合物對ofchti的半數抑制濃度ic50值，為14μm。

圖2是50μm終濃度下化合物kansugamycin對不同物種來源的18家族幾丁質酶(gh18)的抑制活性示意圖。圖中橫坐標表示抑制活性，縱坐標表示不同來源的幾丁質酶。

圖3為50μm化合物kasugamycin對亞洲玉米螟的殺蟲活性示意圖，其中a為對照組，b為實驗組。a、b圖橫坐標表示統計時間，縱坐標表示相應表型的亞洲玉米螟所占的百分比；■代表正常幼蟲，▲代表死亡幼蟲，●代表正常蛹，◆代表不正常蛹。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思進行等同替換或改變均屬于本發明保護范疇。

本發明實施例中所用的酶ofchti如下述參考文獻給出：leichen,t.l.,yongzhou,qichen,xushenandqingyang,structuralcharacteristicsofaninsectgroupichitinase,anenzymeindispensabletomoulting.actacrystallographicasectiondbiologicalcrystallography2013,issn,1399-0047.

實施例1

將幾丁質酶ofchti作為靶標，對556個微生物次級代謝產物進行抑制劑篩選。具體步驟如下：

正對照：設置2組平行正對照。在30℃反應溫度，100μl反應體系的條件下，2nmol/l糖基水解酶ofchti和50μmol/l底物(mu-(glcnac)2)在20mmol/l的ph6.0的磷酸鹽緩沖液中孵育30min，之后加入100μl0.5mol/l碳酸鈉溶液終止反應，反應液用360nm波長的激發光進行激發后測定450nm波長下的吸光度值。

實驗組：設置3組平行實驗組。在30℃反應溫度，100μl反應體系的條件下，2nmol/l糖基水解酶ofchti和50μmol/l底物(mu-(glcnac)2)以及50μm化合物在20mmol/l的ph6.0的磷酸鹽緩沖液中孵育30min，之后加入100μl0.5mol/l碳酸鈉溶液終止反應，反應液用360nm波長的激發光進行激發后測定450nm波長下的吸光度值。

根據以下公式計算抑制活性

抑制百分數＝(正對照-實驗組)/正對照*100

篩選來源的微生物次級代謝產物經由各類真菌發酵產生，數目較大(556個)，種類豐富，結構差異明顯，主要有抗生素、激素、生物堿、各類毒素及維生素等，其中化合物kasugamycin屬于氨基糖苷類化合物。對抑制劑進行篩選時，先進行長時間的初篩，在初篩的基礎上對初篩獲得的陽性結果進行進一步的復篩(具體步驟同上)確認后獲得最終數據，結果表明，化合物kasugamycin對ofchti具有抑制效果，在50μm終濃度下對ofchti抑制率分別為86.4％。

實施例2

1)半數抑制濃度ic50測定

ofchti：mu-(glcnac)2作為底物，底物濃度為30μm。在相同底物濃度下取終濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μm八組化合物濃度梯度進行抑制活性測定。反應體系為100μl，緩沖環境為20mm磷酸鹽緩沖液，ph6.0，酶終濃度為2nm，反應溫度30℃，反應時間30min，之后加入100μl濃度為0.5m的碳酸鈉溶液終止反應，釋放的mu經由360nm激發光激發后于450nm波長下測定其吸光度值。數據擬合后得ic50＝14μm，結果如圖2所示。

2)化合物的適用對象測定

gh18：選擇7個不同物種來源的18家族幾丁質酶對化合物kasugamycin的抑制活性進行評價，6個幾丁質酶分別為來源于亞洲玉米螟的ofchti，來源于人的殼三糖酶hschit1，來源于煙曲霉的afchib1以及來源于粘質沙雷氏菌的smchia、smchib和smchic。反應設置2組平行對照組和3組平行實驗組。mu-(glcnac)2作為底物，終濃度為30μm，化合物kasugamycin終濃度為50μm。反應體系為100μl，緩沖環境為20mm磷酸鹽緩沖液，ph6.0，各幾丁質酶終濃度為2nm，反應溫度30℃，反應時間30min，之后加入100μl濃度為0.5m的碳酸鈉溶液終止反應，釋放的mu經由360nm激發光激發后于450nm波長下測定其吸光度值。根據實施例1中公式計算抑制活性。

實施例3

化合物kasugamycin的殺蟲活性評價具體步驟如下：

實驗選取五齡第四天的健康幼蟲作為實驗材料，設置對照組和實驗組。化合物kasugamycin用h2o溶解，濃度為500μm。對照組幼蟲注射2μl的h2o，實驗組幼蟲注射2μl濃度為500μm的化合物kasugamycin。注射后的幼蟲于26℃，相對濕度70％-90％，每天16小時光照，8小時黑暗的條件下培養至全部化蛹為止，期間每天對正常幼蟲、死亡幼蟲、正常蛹和不正常蛹的數量和表型進行統計。統計結果繪制成圖3，其中a為對照組，b為實驗組。結果表明，實驗組幼蟲的發育被延緩。