本發(fā)明涉及植物種質(zhì)資源保存技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種紫參薯種質(zhì)的離體保存和恢復(fù)方法。
背景技術(shù):
紫參薯(dioscoreaalata.l)為薯蕷科薯蕷屬纏繞草質(zhì)藤本植物,又名紫人參、紫山藥,在我國南方的浙江、江西、福建、臺灣地區(qū)、廣東等省區(qū)有廣泛栽培,其塊莖橢圓形至扁圓形,表皮紫褐色,肉質(zhì)亮紫色,含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、薯蕷皂苷和花青素等營養(yǎng)物質(zhì),具有滋肺益腎、健脾止瀉、降血脂血糖、調(diào)節(jié)人體免疫力等功效,是藥食兼用的作物之一。紫參薯為無性繁殖作物,在田間正常條件下不結(jié)零余子,主要以塊莖進(jìn)行繁殖。目前紫參薯種質(zhì)資源保存主要采用大田塊莖繁殖保存,該方法費(fèi)時費(fèi)力,且易遭受各種自然災(zāi)害和病蟲害的影響,造成種質(zhì)丟失,保存時間短,保存效果差。利用一般的組織培養(yǎng)技術(shù)保存紫參薯種質(zhì)資源,試管苗需要定期繼代培養(yǎng)(每隔1-2個月轉(zhuǎn)接一次),不斷的重復(fù)工作造成大量人力物力的浪費(fèi),同時污染機(jī)會也可能提高。而采用低溫或超低溫保存技術(shù),操作程序較繁瑣、設(shè)備成本大、耗能高。為此,在常溫條件下,探索適合紫參薯種質(zhì)緩慢生長,以延長繼代周期和降低保存成本的種質(zhì)保存技術(shù)對當(dāng)前種質(zhì)資源離體保存具有十分重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種紫參薯種質(zhì)離體保存與恢復(fù)方法,以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
一種紫參薯種質(zhì)離體保存與恢復(fù)方法,包括如下步驟:
1)外植體的獲得與消毒處理
取健康、無病害的紫參薯塊莖中部切塊盆栽沙培獲得紫參薯幼苗,切取幼苗帶節(jié)嫩莖于燒杯中,流水沖洗1~2h后,用洗衣粉濃溶液15~30min,自來水蕩洗干凈后,轉(zhuǎn)置超凈工作臺上用體積濃度為70%酒精浸泡30~60s,轉(zhuǎn)入2%次氯酸鈉溶液中浸泡10~15min,然后無菌水漂洗3-5次,每次漂洗時間為1~3min;無菌水洗凈后獲得消毒的紫參薯嫩莖外植體;
2)無菌苗的獲得:將步驟1)已消毒的嫩莖放于超凈工作臺上,切成帶單節(jié)莖段,長約2cm左右,同時切除葉柄、枝莖等多余部分,接種于以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加激動素1.0~2.0mg/l、萘乙酸0.2~0.5mg/l、蔗糖30g/l、瓊脂7~8g/l的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上;培養(yǎng)基用1mol/lhcl或1mol/lnaoh,調(diào)整ph值到5.8,并加入0.1%活性炭,攪拌均勻后,分裝于200ml組培瓶,每升分裝40瓶,在121℃下滅菌25min后,拿出冷切后即可用;將消毒處理好的外植體接種于上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,密封無菌培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間8~12h/d,溫度為25±2℃,培養(yǎng)3~4周后為獲得無菌試管苗。
3)試管苗的繼代培養(yǎng):取步驟2)獲得的無菌試管苗,于超凈工作臺上用手術(shù)剪刀剪除葉片后,將試管苗切成帶單節(jié)莖段,長約為1~1.5cm,節(jié)上部分長約為節(jié)下部分長的2倍,取莖段形態(tài)學(xué)下端分別插入固體保存培養(yǎng)基和對照繼代培養(yǎng)基中,密封無菌培養(yǎng),觀察統(tǒng)計存活率;所述固體保存培養(yǎng)基以1/3~1/2ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素2.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、20~30mg/l甘露醇、60mg/l蔗糖、7~8mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間8~12h/d,溫度為25±2℃。
4)繼代恢復(fù)培養(yǎng):取步驟3)已在固體保存培養(yǎng)基中保存培養(yǎng)16個月的紫參薯試管苗,切取試管苗帶單節(jié)莖段,長約為1~1.5cm,接種于恢復(fù)培養(yǎng)基以ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素1.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、30mg/l蔗糖、7~8mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間8~12h/d,溫度為25±2℃。
紫參薯試管苗在步驟3)固體保存培養(yǎng)基中常溫培養(yǎng),植株生長非常緩慢,根系變粗變短,節(jié)間明顯縮短,葉片小、多且密,分蘗多,保存后期部分葉片變黃,培養(yǎng)16個月后,存活率仍達(dá)85%;保存時間是常規(guī)繼代培養(yǎng)的8倍以上。步驟4)繼代恢復(fù)培養(yǎng)2個月后,形成的試管苗植株生長正常,與常規(guī)組培苗無顯著差異。
本發(fā)明提供了一種紫參薯種質(zhì)離體保存與恢復(fù)方法,該保存方法具有操作簡單,所需設(shè)備簡單,節(jié)省大量人力物力,成本低,保存時間長,不受季節(jié)限制,安全可靠,便于種質(zhì)交流等優(yōu)點(diǎn)。
附圖說明
圖1為紫參薯種質(zhì)組培苗接種在常規(guī)繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)2個月的圖;
圖2為紫參薯種質(zhì)組培苗接種到本發(fā)明保存培養(yǎng)基培養(yǎng)12個月左右圖;
圖3為紫參薯種質(zhì)組培苗接種到本發(fā)明保存培養(yǎng)基培養(yǎng)16個月左右圖;
圖4為紫參薯種質(zhì)在本發(fā)明固體保存培養(yǎng)基保存16個月后繼代恢復(fù)培養(yǎng)2個月圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種紫參薯種質(zhì)離體保存與恢復(fù)方法,其具體步驟如下:
1、外植體的獲得與消毒處理
取健康、無病害的紫參薯塊莖中部切塊盆栽沙培獲得紫參薯幼苗,切取幼苗帶節(jié)嫩莖于燒杯中,流水沖洗2h后,用洗衣粉濃溶液浸泡15min,自來水蕩洗干凈后,轉(zhuǎn)置超凈工作臺上用體積濃度為70%酒精浸泡30s,轉(zhuǎn)入2%次氯酸鈉溶液中浸泡15min,然后無菌水漂洗3次,每次漂洗時間為2min;無菌水洗凈后獲得消毒的紫參薯嫩莖外植體;
2、無菌苗的獲得:
將步驟1已消毒的嫩莖放于超凈工作臺上,切成帶單節(jié)莖段,長約2cm左右,同時切除葉柄、枝莖等多余部分,接種于以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加激動素1.5mg/l、萘乙酸0.2mg/l、蔗糖30g/l、瓊脂8g/l的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上;培養(yǎng)基用1mol/lhcl或1mol/lnaoh,調(diào)整ph值到5.8,并加入0.1%活性炭,攪拌均勻后,分裝于200ml組培瓶,每升分裝40瓶,在121℃下滅菌25min后,拿出冷切后即可用;將消毒處理好的外植體接種于上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,密封無菌培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間10/d,溫度為25±2℃,培養(yǎng)3周后為獲得無菌試管苗。
3、試管苗的繼代培養(yǎng):
取步驟2獲得的無菌試管苗,于超凈工作臺上用手術(shù)剪刀剪除葉片后,將試管苗切成帶單節(jié)莖段,長約為1~1.5cm,節(jié)上部分長約為節(jié)下部分長的2倍,取莖段形態(tài)學(xué)下端分別插入固體保存培養(yǎng)基和對照繼代培養(yǎng)基中,密封無菌培養(yǎng),觀察統(tǒng)計存活率;所述固體保存培養(yǎng)基以1/2ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素2.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、25mg/l甘露醇、60mg/l蔗糖、7.5mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;常規(guī)繼代培養(yǎng)基以ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素2.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、30mg/l蔗糖、7.5mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;培養(yǎng)條件均為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間10h/d,溫度為25±2℃。
4)繼代恢復(fù)培養(yǎng):取上述已在固體保存培養(yǎng)基中保存培養(yǎng)16個月的紫參薯試管苗,切取試管苗帶單節(jié)莖段,長約為1~1.5cm,接種于恢復(fù)培養(yǎng)基,所述的恢復(fù)培養(yǎng)基以ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素1.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、30mg/l蔗糖、7.5mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間10h/d,溫度為25±2℃。
紫參薯試管苗在本發(fā)明固體保存培養(yǎng)基中常溫培養(yǎng),植株生長非常緩慢,根系變粗變短,節(jié)間明顯縮短,葉片小、多且密,分蘗多,保存后期部分葉片變黃,培養(yǎng)16個月后,株高保持在2.4~3.2cm,基部出現(xiàn)個別黃葉,存活率仍達(dá)85%;保存時間是常規(guī)繼代培養(yǎng)的8倍以上。而在常規(guī)繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)下,紫參薯試管苗葉片大、少,分枝少,株高達(dá)7cm以上,2個月左右出現(xiàn)大量黃葉,甚至有枯苗。取在本發(fā)明固體保存培養(yǎng)基上保存16個月后的試管苗莖段繼代恢復(fù)培養(yǎng)2個月后,形成的試管苗植株生長正常,與常規(guī)組培苗無顯著差異。
本實(shí)施例的結(jié)果見圖1至圖4.
實(shí)施例2
1、外植體的獲得與消毒處理
取健康、無病害的紫參薯塊莖中部切塊盆栽沙培獲得紫參薯幼苗,切取幼苗帶節(jié)嫩莖于燒杯中,流水沖洗1h后,用洗衣粉濃溶液20min,自來水蕩洗干凈后,轉(zhuǎn)置超凈工作臺上用體積濃度為70%酒精浸泡45s,轉(zhuǎn)入2%次氯酸鈉溶液中浸泡10min,然后無菌水漂洗4次,每次漂洗時間為2min;無菌水洗凈后獲得消毒的紫參薯嫩莖外植體;
2、無菌苗的獲得:
將步驟1已消毒的嫩莖放于超凈工作臺上,切成帶單節(jié)莖段,長約2cm左右,同時切除葉柄、枝莖等多余部分,接種于以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加激動素1.5mg/l、萘乙酸0.25mg/l、蔗糖30g/l、瓊脂7.5g/l的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上;培養(yǎng)基用1mol/lhcl或1mol/lnaoh,調(diào)整ph值到5.8,并加入0.1%活性炭,攪拌均勻后,分裝于200ml組培瓶,每升分裝40瓶,在121℃下滅菌25min后,拿出冷切后即可用;將消毒處理好的外植體接種于上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,密封無菌培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間9h/d,溫度為25±2℃,培養(yǎng)3周后為獲得無菌試管苗。
3、試管苗的繼代培養(yǎng):
取步驟2獲得的無菌試管苗,于超凈工作臺上用手術(shù)剪刀剪除葉片后,將試管苗切成帶單節(jié)莖段,長約為1~1.5cm,節(jié)上部分長約為節(jié)下部分長的2倍,取莖段形態(tài)學(xué)下端分別插入固體保存培養(yǎng)基和對照繼代培養(yǎng)基中,密封無菌培養(yǎng),觀察統(tǒng)計存活率;所述固體保存培養(yǎng)基以1/3ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素2.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、30mg/l甘露醇、60mg/l蔗糖、8mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;常規(guī)繼代培養(yǎng)基以ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素2.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、30mg/l蔗糖、8mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;培養(yǎng)條件均為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間9h/d,溫度為25±2℃。
4)繼代恢復(fù)培養(yǎng):取上述已在固體保存培養(yǎng)基中保存培養(yǎng)16個月的紫參薯試管苗,切取試管苗帶單節(jié)莖段,長約為1~1.5cm,接種于恢復(fù)培養(yǎng)基以ms為基本培養(yǎng)基,添加激動素1.0mg/l、萘乙酸0.2mg/l、30mg/l蔗糖、8mg/l瓊脂、0.1%活性炭,ph=5.8;培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2000lux,光照時間9h/d,溫度為25±2℃。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用于限制本發(fā)明,因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的同等變化,仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。