本發明屬于畜牧業養殖技術領域，涉及一種牛冷凍精液稀釋液制備方法。
背景技術：
牛冷凍精液與人工授精技術在我國養牛業生產中已廣泛應用，因此牛冷凍精液的生產與質量控制一直受到行業內的關注。
實踐證明，冷凍精液生產是各地種公牛站的核心業務，該生產流程體系應該建立在標準化作業程序的基礎上，包括生產牛冷凍精液的器械清洗與消毒、稀釋液配制、采精、精液處理、精液冷凍、凍精解凍、凍精鏡檢和檢驗規則、凍精包裝、凍精貯存及凍精運輸等操作環節。
目前大部分種公牛站以進口稀釋粉取代自配精液稀釋液，進口稀釋粉在某種程度上取得了較好效果，但從長遠考慮這增加了牛冷凍精液的生產成本，降低了經濟效益，同時也反映出牛冷凍精液稀釋液配方的缺陷。
眾觀各地種公牛站冷凍精液稀釋液，不論是自配的或是進口的，其中均包括稀釋劑、營養劑、保護劑和其他添加劑等。目前，牛冷凍精液稀釋液多數為葡萄糖-甘油-卵黃液，但稀釋劑、營養劑、保護劑又有可選的不同化學物質和劑量組合，大部分種公牛站反映進口稀釋液比自配稀釋液稀釋效果好。
牛細管凍精質量高低與假陰道安裝調試、種公牛準備與調教、采精人員技術水平、采精操作的規范性、精液品質評價與稀釋倍數計算、稀釋液配方與配制、精液稀釋過程的規范性、稀釋精液冷凍過程等多項因素有關。各環節操作人員大部分進過職業技能培訓，規范性較強，最大的區別是精液稀釋液不同，導致稀釋后精子活力偏低。
首先，目前牛細管凍精稀釋液營養劑選擇葡萄糖、蔗糖存在不足，從有利于精子代謝吸收的角度考慮，應選擇果糖，因為果糖結構簡單，在同等條件下更有利于精子代謝吸收，滿足精子營養需求；其次，作為維持精子內外環境滲透壓平衡的檸檬酸鈉，其用量把握不精準，不能維持溶液的等滲性，引起精子變形；第三，青鏈霉素作為抗菌物質，原本是為了提高精子抗污染能力，但用量失控尤其偏多時反而會殺死精子或降低精子活力；第四，雞蛋新鮮度和消毒把控不嚴，營養價值降低；第五，抗凍物質甘油用量不合理，未能達到相應的抗凍效果，超量時反而降低了精子對營養物質的吸收量；第六，牛冷凍精液生產的操作細節缺乏規范性。
總之，稀釋液配方中各物質用量搭配缺乏合理性，同時，有必要進一步探索更科學的牛細管凍精生產工藝。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，解決了現有技術中存在的問題，提高優秀種公牛新鮮精液稀釋效果和精子活率，達到冷凍精液長期有效保存。
本發明所采用的技術方案是，一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，按照以下步驟進行：
步驟1：精液稀釋液配置；
按比例，準確稱取果糖5～8g、檸檬酸鈉19.8～26.6 g，無損耗地移入1000 mL的燒杯內，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75～80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180～220mL的新鮮卵黃，以及再加入青霉素、鏈霉素各40～50萬IU單位，按此比例配置的溶液稱為第一液；
取第一液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分攪拌均勻后放入3℃～5℃的冰箱或生化培養箱內待用，按此比例配置的溶液稱之為第二液；
步驟2：精液稀釋；
用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0～5℃低溫柜內降溫，與此同時把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當降溫至10℃時加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低溫柜中進行細管分裝，分裝后的細管即可進行冷凍；
步驟3：精液冷凍；
將平衡、封裝后的細管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架碼放，碼放在平衡架上，超聲波封口端遠離操作者，細管放入冷凍儀時也應如此放置；每個平衡架上放一根細管的標記物，為了便于識別，一頭種公牛用同一顏色的標記物；如果同一個平衡架上有不同種公牛的細管精液，須分開碼放，且要隔開一些距離，以免混淆；
在細管凍精生產過程中，使用由計算機控制的全自動冷凍儀，首先在電腦中設置好最佳冷凍溫度曲線，冷凍儀與低溫柜應盡量靠近，開啟液氮罐閥門把冷凍儀降溫至4℃，關閉風扇電源，待風扇完全停止后把已排滿待凍細管的平衡架迅速輕放人冷凍儀，蓋好蓋子，按預先設定的程序自動完成冷凍過程；
步驟4：凍精解凍與抽檢；
預先把水浴箱水溫加熱至38～40℃，用鑷子夾取一支冷凍后的細管凍精迅速浸入38～40℃水中并輕輕晃動，待溶解后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用細管專用剪剪去超聲波封口端，滴一小滴精液于經過預熱的載玻片上即可進行鏡檢，評價精子活率；
步驟5：凍精包裝；
在-140℃以下的環境中，用細管計數分裝機進行包裝，包裝后的細管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置，塑料包裝管的內徑應均勻一致，不得用上口大、底部小的塑料管，包裝好的細管凍精人庫貯存。
進一步的，所述步驟2中，細管分裝使用細管灌封一體機進行。
進一步的，還包括步驟6，凍精貯存；凍精貯存在液氮罐的液氮中，每周定時加一次液氮，當發現液氮罐外殼出現白霜時，應立即將精液轉移人其他液氮罐內保存；包裝好的凍精液氮罐間轉換時，在液氮罐外停留時間不能超過3s；取存凍精后要蓋好液氮罐塞，在取放蓋塞時，要垂直輕拿輕放，不得用力過猛，防止液氮罐塞折斷或損壞；移動液氮罐時，應提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動，不得在地上拖行。
進一步的，還包括步驟7：凍精運輸；凍精運輸過程不得橫倒、碰撞和強烈振動，保證凍精始終浸在液氮中。
進一步的，所述步驟中，所加第一液的量=[（稀釋液總量+合格精液量）／2] -合格精液量；
稀釋液總量=原精液量×（稀釋倍數-1）；
稀釋倍數=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷凍后精子活力)/每頭份輸精量所含有效精子數/ 0.25；
所加第二液的量=（所加稀釋液總量一所加第一液的量）。
本發明的有益效果是：首先，篩選出了優良的牛冷凍精液稀釋液種類，目前，牛冷凍精液稀釋液有卵黃—磷酸鹽稀釋液、果糖—卵黃—檸檬酸鹽—甘油稀釋液、卵黃—Tris稀釋液和全脂均質乳和脫脂乳等幾種，經過大量試驗研究，結果表明：在原精液品質合格和操作規范的前提下，果糖—卵黃—檸檬酸鈉—甘油稀釋液的稀釋效果最好；第二，優化了稀釋液中所用化學物質的配比，縱觀牛冷凍精液稀釋液配方，所用的基本化學物質大同小異，但各物質配比各不相同，本發明研究出了果糖、檸檬酸鈉、卵黃、青鏈霉素、甘油等的最佳配方，提高了合格精液的稀釋效果；第三，進一步規范了牛精液稀釋液配制、精液稀釋過程、稀釋精液的灌封、平衡降溫、冷凍、包裝、貯存和運輸等技術環節，為制定牛細管凍精生產規程提供了理論依據與技術支撐。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，在制備稀釋液之前具有以下要求：
制備蒸餾水：嚴格按照全自動雙重純水蒸餾器的操作說明書制備雙蒸水，蒸餾水最好用干凈的玻璃器皿貯存。
天平放置在平穩的工作臺上，保持清潔干燥，不使用時刀口應處于空載狀態；稱取藥品時，盤內墊以稱量紙，校零后方可稱重。砝碼要求保持清潔、干燥，防止受潮或污染。
配制稀釋液所用的化學藥品規格為分析純，且在保質期內，藥品取用后，應立即將瓶口蓋嚴，并妥善保存；藥品一旦從瓶中取出，再不能放回藥品瓶而統一收集，妥善處理。
用于配制稀釋液的雞蛋應來源于無疫病的雞場，且新鮮、完整、干凈，用75%酒精棉球對蛋殼表面進行徹底消毒，等酒精揮發盡后用蛋清分離器取出完整的卵黃（也可在雞蛋腰正中線處敲開一裂紋，將雞蛋一分為二，利用兩個蛋殼交替傾倒，除去蛋清，留下卵黃），然后用滅菌的注射器穿過蛋黃膜抽取卵黃。
具體按照以下步驟進行：
步驟1：精液稀釋液配置
按比例，準確稱取果糖（分析純）5～8g、檸檬酸鈉19.8～26.6 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75～80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180～220mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各40～50萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分攪拌均勻后放入1℃～4℃的冰箱或生化培養箱內待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時間不得超過24 h。
步驟2：精液稀釋
用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0～5℃低溫柜內降溫，與此同時把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當降溫至10℃時加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低溫柜中進行細管分裝，分裝后的細管即可進行冷凍；
所加第一液的量=[（稀釋液總量+合格精液量）／2] -合格精液量；
稀釋液總量=原精液量×（稀釋倍數-1）；
稀釋倍數=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷凍后精子活力)/每頭份輸精量所含有效精子數/ 0.25；
所加第二液的量=（所加稀釋液總量一所加第一液的量）。
步驟3：精液冷凍
將平衡、封裝后的細管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架碼放碼放在平衡架上，超聲波封口端遠離操作者，細管放入冷凍儀時也應如此放置。每個平衡架上放一根類似于細管的標記物，為了便于識別，最好一頭種公牛用同一顏色的標記物。如果同一個平衡架上有不同種公牛的細管精液，必須要分開碼放，且要隔開一些距離，以免混淆。
在細管凍精生產過程中，使用由計算機控制的全自動冷凍儀，首先在電腦中設置好最佳冷凍溫度曲線，冷凍儀與低溫柜應盡量靠近，開啟液氮罐閥門把冷凍儀降溫至4℃，關閉風扇電源，待風扇完全停止后把已排滿待凍細管的平衡架迅速輕放人冷凍儀，蓋好蓋子，按預先設定的程序自動完成冷凍過程。
步驟4：凍精解凍與抽檢
預先把水浴箱水溫加熱至38～40℃，用鑷子夾取一支冷凍后的細管凍精迅速浸入38～40℃水中并輕輕晃動，待溶解后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用細管專用剪剪去超聲波封口端，滴一小滴精液于經過預熱的載玻片上即可進行鏡檢，評價精子活率。
步驟5：凍精包裝
在-140℃以下的環境中，用細管計數分裝機進行包裝，包裝后的細管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置。塑料包裝管的內徑應均勻一致，不得用上口大、底部小的塑料管。包裝好的細管凍精人庫貯存。
步驟6：凍精貯存
凍精貯存在液氮罐的液氮中，由專人保管，每周定時加一次液氮，應經常檢查液氮罐的狀況，當發現液氮罐外殼出現白霜時，應立即將精液轉移人其他液氮罐內保存。包裝好的凍精液氮罐間轉換時，在液氮罐外停留時間不能超過3s。取存凍精后要蓋好液氮罐塞，在取放蓋塞時，要垂直輕拿輕放，不得用力過猛，防止液氮罐塞折斷或損壞。移動液氮罐時，應提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動，不得在地上拖行。
步驟7：凍精運輸
凍精運輸過程中要有專人看守，注意貯存容器不得橫倒、碰撞和強烈振動，保證凍精始終浸在液氮中。
本文中，檸檬酸鈉作為緩沖物質，防止精液處理過程中pH的變化，同時對代謝性酸中毒和酶活性反應具有良好的緩沖作用。研究表明：稀釋液中添加19.8～26.6 g檸檬酸鈉復蘇后精子活力最高，環性精子活力最低。否則冷凍精液復蘇精子活力極低，降低母牛情期受胎率。
糖在稀釋液中具有營養、增加稀釋液的滲透壓和在低溫環境中保護精子等多重作用，不同糖類及其用量對同種動物精子冷凍保存效果不同，同種糖及其用量對不同動物精子冷凍保存效果也不同，常用的糖類有葡萄糖、蔗糖、果糖等。研究認為，果糖依其生物特性，作為供給牛精子能量的成分，更易利用，效果最好，選擇該用量能取代精子膜周圍的水分子與膜中磷酸基團形成氫鍵，對精子膜結構有穩固和修復作用。
常用抗凍劑有EDTA、二甲基亞砜、低濃度甲醛（0.025%）和甘油。其中甘油作為精子超低溫冷凍過程中最好的抗凍保護劑，具有溶于水的特性，不易發生結晶，同時具有吸水性強和可降低水溶液冰點的特點。在配制精液稀釋液時，甘油用量控制在13%～14%為最好，低于13%抗凍效果很低，達到或超過18%會對精子產生毒害作用。
卵黃具有保護精子免受冷休克的影響，能防止精子內部液相轉變的作用，同時卵黃可通過促進精子與卵細胞透明帶的結合而使頂體反應率提高，在精液稀釋液中添加本文含量的卵黃，使母牛情期受胎率達75%以上。
在細管凍精生產中，用青霉素和鏈霉素來控制精液中病源性和非病源性疾病，它具有抗菌范圍廣、成本低等特點。按照此精液稀釋液配方中抗生素用量，通過重點控制性病和孤菌病來提高母牛情期受胎率。低于40萬IU單位時稀釋精液易受病原微生物污染，超過50萬IU單位時，抗生素本身對精子產生過高殺傷力，兩者均降低精子活力和母牛情期受胎率40%～70%。
總之，在牛精液稀釋液配方中，通過科學合理選擇稀釋劑、營養劑、保護劑和其他添加劑及其用量的最佳組合，同時規范精液稀釋和細管凍精生產工藝的每一個細節。在規范操作的基礎上，能提高細管凍精解凍后活力10%～15%，維持母牛情期受胎率75%以上，同時對加速黃牛改良步伐和提高種公牛站生產凍精的經濟效益及區域社會效益必將產生積極作用。
實施例1
按比例，準確稱取果糖5 g、檸檬酸鈉26.6 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180 mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各40萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入65 mL甘油，并用磁力攪拌器充分攪拌均勻后放入1℃冰箱或生化培養箱內待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時間不得超過24 h。
用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0℃低溫柜內降溫，與此同時把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當降溫至10℃時加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低溫柜中進行細管分裝，分裝后的細管即可進行冷凍。
實施例2
按比例，準確稱取果糖8g、檸檬酸鈉26.6 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入220 mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各50萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分攪拌均勻后放入4℃的冰箱或生化培養箱內待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時間不得超過24 h。
用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送5℃低溫柜內降溫，與此同時把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當降溫至10℃時加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低溫柜中進行細管分裝，分裝后的細管即可進行冷凍。
實施例3
按比例，準確稱取果糖6 g、檸檬酸鈉23 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置78℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入200 mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各45萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入70 mL甘油，并用磁力攪拌器充分攪拌均勻后放入2℃的冰箱或生化培養箱內待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時間不得超過24 h。
用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送3℃低溫柜內降溫，與此同時把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當降溫至10℃時加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低溫柜中進行細管分裝，分裝后的細管即可進行冷凍。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用于限定本發明的保護范圍。凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均包含在本發明的保護范圍內。