一株裂褶菌及其馴化栽培方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株裂褶菌及其馴化栽培方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)俗稱：八擔(dān)柴、白花、天花菌、白參菌、樹花。隸屬于真菌界(Mycota)，真菌門(Eumycota)，擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，傘菌目(Agaricales)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)，裂褶菌屬(Schizophyllum)。

裂褶菌子實(shí)體個(gè)頭小，呈扇形或掌狀開裂，通常覆瓦狀疊生、簇生或群生，形似小菊花。菌蓋長(zhǎng)為6～50mm，寬8～30mm，厚1～3mm，菌蓋表面白色、灰白色、肉褐色至黃棕色，密披茸毛或粗毛，具有多個(gè)裂瓣，韌肉質(zhì)至軟革質(zhì)，邊緣內(nèi)卷。菌褶白色、灰白色、淡肉色或帶紫褐色，不等長(zhǎng)，褶緣中部縱裂成深溝紋。菌肉厚約1mm，白色，革質(zhì)，柔韌，無味，干后強(qiáng)烈收縮，吸水后恢復(fù)原狀。子實(shí)體無柄或有短柄。孢子印白色或淡肉色，擔(dān)孢子5～7×2～3.5μm，橢圓形或臘腸形，光滑，無色，非淀粉質(zhì)。

分布：裂褶菌廣泛分布于世界各地，在我國(guó)大部分省市均有分布，菌種資源非常豐富。

生境：散生至群生，常疊生于腐木或腐竹上

藥效：裂褶菌子實(shí)體幼時(shí)，質(zhì)嫩味美，具有特殊的濃郁香味，性平，味甘，能滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本、鎮(zhèn)靜作用，治療神經(jīng)衰弱、精神不振、頭昏耳鳴、虛汗，是一種高檔食藥用菌，其代謝產(chǎn)物具有較好的藥用價(jià)值。裂褶菌子實(shí)體或菌絲體含有豐富的免疫性多糖、蛋白質(zhì)、生物活性L型氨基酸、多種必需氨基酸和微量元素等，這些物質(zhì)分別對(duì)心血管和肝、腎等多種器官疾病具有防治作用，并具有抗癌、抗衰老、抗炎癥等功效，具有提高機(jī)體免疫力、抗菌消炎、抗輻射等多種生理活性，具有良好的食用和藥用價(jià)值。目前裂褶菌多糖已被開發(fā)成抗腫瘤制劑，結(jié)合放化療用于治療子宮頸癌、胃癌和乙肝病毒等的治療中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供可食藥兩用的，采自廣東地區(qū)的裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099，該菌株已于2016年4月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，湖北省武漢市洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué))，保藏號(hào)為：CCTCC NO：M 2016236。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099的馴化栽培方法，其特征在于，包括以下步驟：

在無菌條件下將裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099母種接種到裝有原種培養(yǎng)基的袋中，于25℃恒溫下遮光培養(yǎng)，直至菌絲吃滿料即得原種，原種在無菌條件下接種到裝有栽培料培養(yǎng)基的袋中，于25℃恒溫下，空氣相對(duì)濕度為60-70％避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿栽培料培養(yǎng)基后，進(jìn)行出菇管理；

所述的出菇管理是控制溫度在23±1℃之間，空氣相對(duì)濕度60-80％之間，光照為100-200lux，二氧化碳含量剛出原基時(shí)控制在2000ppm以上，在子實(shí)體生長(zhǎng)期，調(diào)整溫度20-23℃之間，空氣相對(duì)濕度70-85％之間，光照約200-300lux，保持二氧化碳含量在1200ppm以下。

所述的原種培養(yǎng)基，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括高粱79％，小米20％，CaCO₃1％，按其含量將各組分混合均勻，然后再加水，使含水量為55-60％，由此得到原種培養(yǎng)基。

所述的栽培料培養(yǎng)基，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括棉籽殼50％，木屑38％，麩皮10％和CaCO₃2％，按其含量將各組分混合均勻后，再加水，使含水量為60％。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099在制備裂褶菌多糖中的應(yīng)用。

本發(fā)明從廣東省分離得到新菌株裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099，該菌株具有非常好的藥食兩用價(jià)值，具有廣闊的應(yīng)用前景。

裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099，該菌株已于2016年4月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，湖北省武漢市洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué))，保藏號(hào)為：CCTCC NO：M 2016236。

附圖說明：

圖1是裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099和現(xiàn)有技術(shù)中的裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-1和裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-2兩兩之間拮抗圖，其中S140099、Sc-1和Sc-2分別代表裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099、裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-1和裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-2。

圖2是在白云山野生的裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099的生長(zhǎng)圖；

圖3是馴化栽培后的裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099的生長(zhǎng)圖。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

一、裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099獲取和鑒定：

本發(fā)明的裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099分離自廣東省廣州市白云山闊葉林倒木上。

裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099的形態(tài)學(xué)特征和ITS序列：

裂褶菌子實(shí)體群生于枯木上，革質(zhì)，菌蓋扇形或掌狀，長(zhǎng)為7～15mm，寬8～20mm，厚2～3mm，表面灰白色，被有粗絨毛，邊緣內(nèi)卷。菌褶淡肉色，不等長(zhǎng)，褶緣中部縱裂成深溝紋。菌肉白色，韌革質(zhì)，約1mm。菌柄短至無。孢子印淡肉色，孢子在光學(xué)顯微鏡下無色，透明，孢子橢圓形，2.57～3.92×5.3～6.43μm。

采用生工Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099菌絲體DNA，以ITS1、ITS4為引物進(jìn)行ITS-PCR，產(chǎn)物測(cè)序后得到堿基數(shù)為636bp的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，經(jīng)GenBank序列BLAST比對(duì)分析，與其上已發(fā)表的JX848644.1和JF439509.1等裂褶菌菌株的序列相似性均高達(dá)99％，確定該分離的菌株為Schizophyllum commun，命名為：裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099。

二、拮抗實(shí)驗(yàn)

用普通PDA培養(yǎng)基制作平板培養(yǎng)基(直徑9cm、)，p H自然，按三角形接種法分別接入裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099、裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-1和裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-2的菌種塊(約5mm見方菌塊)，分別做3個(gè)重復(fù)，用封口膜封口后，在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)至3個(gè)種的菌絲相互充分接觸，觀察是否存在拮抗線，并拍照記錄。

如圖1可見，裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099和現(xiàn)有技術(shù)中的裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-1和裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-2兩兩之間均存在明顯拮抗線，由于遺傳特性不同使得菌絲體具有不相融性，菌絲體拮抗反應(yīng)是這種不相融狀態(tài)肉眼可見的指標(biāo)之一，結(jié)果表明，裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099和現(xiàn)有技術(shù)中的裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-1和裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-2之間均存在明顯的遺傳差異，可判斷裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099和現(xiàn)有技術(shù)中的裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-1和裂褶菌(Schizophyllum commune)Sc-2均為不同菌株。

三、馴化栽培

1.培養(yǎng)基

1)組織分離及母種培養(yǎng)基

配方：綜合PDA(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括馬鈴薯20％+葡萄糖2％+瓊脂2％+磷酸二氫鉀0.3％+硫酸鎂0.15％+維生素B1微量，溶劑為水，即其做法是先將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20～30分鐘，能被玻璃棒戳破即可)，用八層紗布過濾，得濾液，濾液中加入20g葡萄糖、20g瓊脂，3g磷酸二氫鉀、1.5g硫酸鎂，維生素B1微量，然后用水補(bǔ)足到1L，滅菌。

2)原種培養(yǎng)基

配方：按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括高粱79％，小米20％，CaCO₃1％，按其含量將各組分混合均勻，然后再加水，使含水量為55-60％。

3)栽培料培養(yǎng)基

通過不同配方成分和含量比較實(shí)驗(yàn)，最終確定最佳配方：按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括棉籽殼50％，木屑38％，麩皮10％，CaCO₃2％，將上述成分混合均勻后，再加水，使含水量60％。

2.栽培技術(shù)參數(shù)

1)菌絲培養(yǎng)

無菌條件下通過組織分離、純化后獲得裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099母種；在無菌條件下將裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099母種接種到裝有原種培養(yǎng)基的袋中，于25℃恒溫下遮光培養(yǎng)，直至菌絲吃滿料即得原種。原種在無菌條件下接種到裝有栽培料培養(yǎng)基的袋中，于25℃恒溫下，空氣相對(duì)濕度為60-70％避光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿栽培料培養(yǎng)基后，進(jìn)行出菇管理。該全過程約需20-25天。

2)出菇條件

控制溫度在23±1℃之間，空氣相對(duì)濕度60-80％之間，光照約為100-200lux，二氧化碳含量剛出原基時(shí)控制在2000ppm以上。在子實(shí)體生長(zhǎng)期，調(diào)整溫度20-23℃之間，空氣相對(duì)濕度70-85％之間，光照約200-300lux，保持二氧化碳含量在1200ppm以下。

3.出菇情況

1)生長(zhǎng)周期：

將原種接種至栽培袋中13-15天后菌絲長(zhǎng)滿袋，5-7天后出原基，5-7天后子實(shí)體成熟可采收，從栽培袋接種到采收整個(gè)生長(zhǎng)周期約23-28天。

2)產(chǎn)量：每個(gè)菌袋每潮出菇45-60克之間，可出三潮，總體生物轉(zhuǎn)化率約在70-85％之間。

子實(shí)體性狀：

四、粗多糖含量測(cè)定

1.裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099子實(shí)體粗多糖的提取

取裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099菌種馴化栽培后的裂褶菌子實(shí)體，粉碎后，按照1：30的料液比，在100℃下浸提2小時(shí)，過濾，濃縮后用4倍體積的無水乙醇沉淀過夜，透析，得裂褶菌子實(shí)體粗多糖溶液。

2.多糖含量測(cè)定

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1676-2008)食用菌中粗多糖的含量測(cè)定對(duì)裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099子實(shí)體粗多糖含量(粗多糖/子實(shí)體干重×100％)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得其多糖含量為5.17％，據(jù)文獻(xiàn)記載，裂褶菌多糖(SPG)具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒等作用。因此，該裂褶菌(Schizophyllum commune)HMGIM-S140099具有較好的開發(fā)潛質(zhì)。

序列表

<110> 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測(cè)中心）

<120> 一株裂褶菌及其馴化栽培方法和應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> 裂褶菌(Schizophyllum commune) HMGIM-S140099

<400> 1

TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ACGAATCAAA CAAGTTCATC TTGTTCTGAT 60

CCTGTGCACC TCATGTAGTC CCAAAGCCTT CACGGGCGGC GGTTGACTAC GTCTACCTCA 120

CACCTTAAAG TATGTTAACG AATGTAATCA TGGTCTTGAC AGACCCTAAA AAGTTAATAC 180

AACTTTCGAC AACGGATCTC TTGGCTCTCG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA 240

AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACC TTGCGCCCTT 300

TGGTATTCCG AGGGGCATGC CTGTTTGAGT GTCATTAAAT ACCATCAACC CTCTTTTGAC 360

TTCGGTCTCG AGAGTGGCTT GGAAGTGGAG GTCTGCTGGA GCCTAACGGA GCCAGCTCCT 420

CTTAAATGTA TTAGCGGATT TCCCTTGCGG GATCGCGTCT CCGATGTGAT AATTTCTACG 480

TCGTTGACCA TCTCGGGGCT GACCTAGTCA GTTTCAATAG GAGTCTGCTT CTAACCGTCT 540

CTTGACCGAG ACTAGCGACT TGTGCGCTAA CTTTTGACTT GACCTCAAAT CAGGTAGGAC 600

TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGC GGAGGA 636