一種高效的虎奶菇多孢分離方法以及使用的多孢分離裝置與流程

本發明涉及一種多孢分離方法，尤其涉及一種高效的虎奶菇多孢分離方法以及使用的多孢分離裝置。

背景技術：

食用菌品種菌種質量的好壞是決定其產量高低和質量優劣的根基，也是食用菌種植效益的最直接影響因子。傳統的菌種質量保持方法在實踐中由于保藏基質、保藏環境以及繼代操作等諸多因素，造成了部分菌種在栽培應用中，表現出生產性能的退化。因此，不少制種和生產單位開始大量應用新分離種作為原始種進行擴繁和生產。

多孢分離指采用分離多孢子獲得純培養物的方法，是食用菌育種的主要方法之一。多孢分離的效果例如孢子萌發率、次生菌絲菌落密度等直接影響優勢菌株篩選效果。

關于菌種多孢分離的研究較多，目前公開及使用的主要以無菌紙收集法和鉤子懸空方法為主，在公開的中國專利申請CN1786149A中，公開了一種傘菌孢子的野外分離方法，將子實體置于無菌紙上，然后將吸有清水的吸水紙貼于器皿內壁，器皿罩住無菌紙，孢子會彈射到無菌紙上，形成孢子印，該方法的主要缺點在于孢子的接觸介質與孢子的接觸面積大，受污染風險高；在公開的中國專利申請CN104396572A中，公開了一種冬蟲夏草菌種孢子的分離提純復壯方法，其中分離采用鉤子懸空方法，包括在試管塞下端錘入一個小鉤，在無菌條件下將菌種的子座下端倒掛于試管塞的小鉤上，使子座尖端部向下，將掛好子座的試管塞塞入斜面試管；該方法的主要缺點在于一方面只能用于較小的子實體，另一方面，每一子實體只能收集于一個培養試管，效率不高。

基于以上情況，需要研究一種高效的、適合于大型子實體且污染風險小的多孢分離方法及裝置。

技術實現要素：

一方面，本發明提供一種高效的虎奶菇多孢分離方法。

一種高效的虎奶菇多孢分離方法，包括：

將多孢分離裝置封口并滅菌，采收菌蓋直徑6-8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實體，切除菌柄，消毒菌蓋表面，打開隔離容器，箘褶朝下地把將菌蓋放置于懸空放置裝置，重新蓋上隔離容器并封口，每隔8-10小時更換一次收集裝置；

所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設置有收集裝置。

優選的，所述消毒菌蓋表面時不要接觸箘褶部位。

優選的，每一次子實體可收集20-24小時。

優選的，當重新蓋上隔離容器后，在隔離容器封口處噴施酒精后，再重新封口。

優選的，所述收集裝置中還有培養基，所述培養基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％，葡萄糖1.5％-2％，磷酸氫二鉀0.05％-0.1％，硫酸鎂0.03％-0.05％，其余為水。

進一步優選的，上述培養基的pH為6.5。

優選的，所述收集裝置中還有培養基，所述培養基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，所述培養基的pH 6.5。

優選的，將收集裝置取出并封口后，在26℃培養箱中避光培養，所述多孢培養的孢子萌發率高，次生菌絲的菌落均勻。

優選的，所述隔離容器包括燒杯；所述懸空放置裝置包括蒸架；所述收集裝置包括培養皿。

優選的，更換子實體后，重新清洗、封口、滅菌多孢分離裝置再使用。

另一方面，本發明還提供一種高效的虎奶菇多孢分離裝置，用于上述高效的虎奶菇多孢分離方法。

一種高效的虎奶菇多孢分離方法使用的多孢分離裝置，所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設置有收集裝置。

優選的，所述懸空放置裝置為直徑10-11厘米、腳高7-8厘米的蒸架。

采用本發明的虎奶菇多孢分離方法分離得到的孢子經過培養后，可以得到大量半透明匍匐狀初生菌絲體菌落，初生菌絲融合后，會出現白色毛氈狀菌落，這些菌落可以用于后續的分離、鑒定或培養等。

采用本發明收集的虎奶菇孢子，收集的孢子的孢子萌發率高，次生菌絲的菌落均勻，從而有助于后續的優勢菌株篩選。。

與現有技術的無菌紙收集法相比，本發明的虎奶菇多孢分離方法孢子的不與中間介質接觸，直接收集到培養基中培養，減少污染風險；與現有技術的鉤子懸空方法相比，本發明可以適用于較大型的子實體，而且可以多次更換收集裝置，每一子實體可以實現多次收集，提高效率。

本發明的高效的虎奶菇多孢分離方法，經實驗證明，污染風險小、效率高，融合后的次生菌絲體生長旺盛，方法和裝置簡化高效。

附圖說明

圖1是虎奶菇多孢分離后的次生菌絲體菌落。

圖2是培養基環境下形成子實體原基的虎奶菇分離菌株。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明進行進一步說明。

食用用菌從孢子萌發時產生初生菌絲，一般認為初生菌絲不具備形成子實體(菇體)的能力，初生菌絲體存在不同交配型，當相匹配的兩個(或兩個以上)交配型初生菌絲體接觸并融合后，可產生具備形成子實體能力的次生菌絲體，在食用菌行業中則稱為菌種。

多孢分離實際上是多孢子間布朗運動、隨機重組的結果，是把許多孢子接種在同一培養基上，讓其萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法，能獲得與原始親本具有不同遺傳背景的菌株。

虎奶菇是一種能產生大體型、厚肉質子實體的側耳屬食用菌，作為食材時能適用多種烹飪方式，口感清爽有嚼勁。營養學研究指出，虎奶菇中含有豐富的蛋白質、礦質元素、多種維生素、真菌多糖、膳食纖維等食藥用成分，蛋白質含量為15.6％、脂肪2.5％、粗纖維6.3％、粗多糖10.8％、總糖34.6％；礦質元素中鉀、鈣、鐵、鋅、硒含量較高，氨基酸總含量為14.9％，其中人體必需的8種氨基酸量占氨基酸總量的46.1％，異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸含量相對較高。并且，有關研究表明，虎奶菇中的虎奶多糖具有提高人體免疫功能、抗腫瘤等神奇效用。

進一步研究表明，虎奶菇屬于偏高溫型食用菌，菌絲體生長、子實體發育都需在25℃以上，適合在我國南方長夏季地區工廠化栽培生產，能極大降低栽培溫控所產生的能耗。因此，虎奶菇是一種非常具有開發價值和潛力的食用菌。

鑒于此，一方面，本發明提供一種高效的虎奶菇多孢分離方法，包括：將多孢分離裝置封口并滅菌，采收菌蓋直徑6-8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實體，切除菌柄，消毒擦拭菌蓋表面，打開隔離容器，箘褶朝下地把將菌蓋放置于懸空放置裝置，重新蓋上隔離容器并重新封口，每隔8-10小時更換一次收集裝置中的培養平板；

所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設置有收集裝置。

在本發明的上述多孢分離方法中，子實體的成熟度以及收集裝置的收集時間對成功分離得到次生菌絲體純培養菌落具有重要的影響，發明人經過反復研究發現，在子實體成熟度小于本發明分離方法所要求成熟度時，收集的多孢菌落稀少，萌發時間長，影響后續優勢菌株挑選，而在子實體大于本發明分離方法所要求成熟度時，收集的多孢密度大，不易分離，并且污染幾率顯著上升；而切除菌柄可以進一步減少污染發生幾率。

其中，上述方法中，所述消毒擦拭菌蓋表面時優選不要接觸箘褶部位，箘褶部位是孢子著生部位，脆弱而容易損傷，當損傷箘褶部位時會影響孢子的彈射；并且，當本發明所述的子實體成熟度時，子實體雖然暴露出箘褶時，但箘褶部位基本是無雜菌的狀態，不接觸箘褶可減少污染風險。

其中，上述方法中，優選每隔8-10小時，例如8小時更換一次收集裝置。該優選的收集時間內，收集的多孢密度適中，有利于后續的菌落分離，并且不易污染。

其中，上述方法中，每一次子實體可收集優選20-24小時，例如24小時。

本發明每一次子實體可以收集2-3次，收集效果高，方便快捷。

其中，上述方法中，當重新蓋上隔離容器后，優選在隔離容器封口處噴施酒精后，再重新封口，降低污染風險。

其中，上述方法中，優選所述收集裝置中還有培養基，具有消毒后培養基的收集裝置在收集多孢后，直接取出，就可以進行后續的培養，減少中間步驟帶來的污染風險，操作方便。

其中，所述培養基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％、優選為0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％、優選為0.2％，葡萄糖1.5％-2％、優選為2％，磷酸氫二鉀0.05％-0.1％、優選為0.1％，硫酸鎂0.03％-0.05％、優選為0.05％，其余為水。

進一步地，上述培養基的pH為6.5。

其中，所述培養基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，培養基的pH為6.5。經研究，這樣的培養基適合于虎奶菇多孢培養。

其中，上述方法中，所述隔離容器在收集虎奶菇過程中提供/保持無菌環境，并且阻斷外界氣流對孢子的彈射影響，使得更多的孢子能夠掉落與收集在收集裝置中，所述隔離容器優選包括玻璃罩，例如燒杯等。

其中，上述方法中，所述懸空放置裝置用于懸空放置子實體，可以根據虎奶菇子實體大小選擇合適的懸空放置裝置，例如蒸架。

對于本發明上述分離方法中的菌蓋直徑6-8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實體，優選采用直徑10-11厘米、腳高7-8厘米的蒸架。

其中，上述方法中，所述收集裝置用于收集彈射的孢子，根據隔離容器大小和收集需求選擇合適大小的收集裝置，例如基于商業方便購買角度，可以使用培養皿作為收集裝置。

其中，上述方法中，更換子實體后，優選重新清洗、封口、滅菌多孢分離裝置再使用。更換子實體會更容易帶來污染風險，為控制/降低污染風險，在更換子實體后，對多孢分離裝置清洗后，重新進行上述多孢分離方法的步驟。

其中，上述方法中，在收集裝置收集完成后，將上述含有培養基的收集裝置取出并封口后，在26℃培養箱中避光培養，例如培養5-7日后，會出現大量半透明匍匐狀初生菌絲體菌落，待初生菌絲融合后，出現白色毛氈狀菌落。

其中，本發明方法收集的多孢培養的孢子萌發率高，次生菌絲的菌落均勻，有助于后續優勢菌落篩選。多孢分離的效果，應以是污染程度、生長旺盛的次生菌絲體菌落致密程度為要點。

應該理解，本發明中所述的多孢分離方法，不僅適用于虎奶菇，還可以用于與虎奶菇具有相似的子實體維持時間的菌種的多孢分離。

本發明的多孢分離方法，不僅可以實現一個子實體2-3次的收集，而且在該收集時間內收集的孢子密度合適，經培養后的次生菌絲菌落均勻，非常有益于后續優勢菌落篩選；此外，本發明方法可以直接收集后培養萌發，不需要再轉接而增加污染風險。

另一方面，本發明還提供一種高效的虎奶菇多孢分離裝置，用于上述高效的虎奶菇多孢分離方法。

一種高效的虎奶菇多孢分離方法使用的多孢分離裝置，所述多孢分離裝置包括：隔離容器，以及隔離容器中的懸空放置裝置，所述懸空放置裝置下方設置有收集裝置。

對于菌蓋直徑6～8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實體，本發明的多孢分離裝置優選采用直徑10-11厘米、腳高7-8厘米的蒸架。

進一步地，所述蒸架為金屬蒸架。

在一個優選的實施例中，蒸架為直徑10.5cm、腳高7.5cm的蒸架或金屬蒸架，蒸架的腳朝向隔離容器開口方向放置。

其中，上述分離裝置中，所述收集裝置用于收集彈射的孢子，根據隔離容器大小和收集需求選擇合適大小的收集裝置，例如基于商業方便購買角度，可以使用培養皿作為收集裝置。

其中，上述分離裝置中，所述收集裝置中還包含有適合于虎奶菇孢子萌發的培養基。上述培養基滅菌后倒入收集裝置中，使用。

本發明中優選的培養基的組分按照重量百分比包括：蛋白胨0.4％-0.5％、優選為0.5％，酵母浸出粉0.1％-0.2％、優選為0.2％，葡萄糖1.5％-2％、優選為2％，磷酸氫二鉀0.05％-0.1％、優選為0.1％，硫酸鎂0.03％-0.05％、優選為0.05％，其余為水。

進一步地，上述培養基的pH為6.5。

本發明中更優選的培養基，包括以下重量百分比組分：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，培養基的pH為6.5。

多孢分離裝置使用時，需要對分離裝置進行封口后滅菌，具體地，將分離裝置組裝完成后，將隔離容器進行封口，并滅菌，例如高壓蒸汽滅菌，滅菌后，干燥容器內水滴，例如在超凈工作臺內采用風機干燥容器內水滴。

本發明中所述的“封口”，如無特別說明，是指對裝置與外界環境進行隔離，特別是對裝置的開口部分與外界環境進行隔離，例如采用報紙或封口膜等。

所述多孢分離裝置按照上述分離方法在分離虎奶菇多孢中使用。

實驗證明，本發明的虎奶菇多孢分離方法簡化、快捷，并且高效，基本能使污染率達到0％，在食用菌育種等方面具有較大應用價值。

實施例1

一種多孢分離裝置，包括2000mL燒杯作為隔離容器，燒杯的杯口直徑約14.5cm，內放置一直徑10.5cm，腳高7.5cm的金屬蒸架作為懸空放置裝置，架腳朝燒杯杯口方向放置，杯口以報紙和橡皮筋封口后，高壓蒸汽滅菌30min(0.1MPa，121℃)，滅菌結束冷卻后取出，放置入超凈工作臺，打開氣流風機，干燥瓶內水滴；另一方面，配制培養基，高壓蒸汽滅菌16min后，稍冷卻，取出于超凈臺中倒入直徑6cm的無菌培養皿，將培養皿置于燒杯內，金屬屬蒸架下面，即得。

培養基的組分為：蛋白胨0.5％，酵母浸出粉0.2％，葡萄糖2％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為水，培養基的pH為6.5。

實施例2

一種高效的虎奶菇的多孢分離方法

本實施例方法采用實施例1的多孢分離裝置，采收表面無雜物污物，菌蓋直徑6～8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的虎奶菇子實體，用已表面消毒的刀沿箘褶與菌柄連接處齊根切除菌柄，用蘸有75％酒精棉球稍拭擦菌蓋表面，但不接觸箘褶部位；將菌蓋部分送入超凈工作臺，摘下分離裝置的報紙(即打開封口)，舉起燒杯，箘褶朝下地把菌蓋放置在蒸架上，重新蓋上燒杯，在燒杯口和底部報紙接觸位置噴施75％酒精，翻折報紙以橡皮筋重新封杯口，開始收集。

每隔8h更換一次培養皿，一個子實體可使用24h，更換3次培養皿進行3次收集，更換子實體后需要重新清洗、封口和滅菌分離裝置。

實施例3

一種高效的虎奶菇的多孢分離方法

本實施例基本采用實施例1的多孢分離裝置，不同的是，將已經準備好的含有培養基的培養皿暫時不放置到燒杯內，而放置在超凈臺中待用，在使用時再組裝。

采收表面無雜物污物，菌蓋直徑6～8cm，箘褶外露而菌蓋邊緣未完全外翻的新鮮虎奶菇子實體，用已表面消毒的刀沿箘褶與菌柄連接處齊根切除菌柄，用蘸有75％酒精棉球稍拭擦菌蓋表面，但不接觸箘褶部位，將菌蓋部分送入超凈工作臺，解開燒杯的封口，舉起燒杯，箘褶朝下地把菌蓋放置在蒸架上，在蒸架之下放入含培養基的培養皿，重新蓋上燒杯，在燒杯口和底部報紙接觸位置噴施75％酒精，翻折報紙以橡皮筋重新封杯口。

每隔8小時更換一次培養皿，一個子實體收集3次。更換子實體后需要重新清洗、封口和滅菌分離裝置。

取出的收集了孢子的培養皿用封口膜封口后置26℃培養箱中避光培養，5-7日后可見大量半透明匍匐狀初生菌絲體菌落，待初生菌絲融合，出現白色毛氈狀菌落，產生氣生菌絲體，如圖1所示，可挑選出并移接到新的培養基上根據需要進行后續分離、鑒定或培養操作。

實施例4

將實施例3收集孢子后培養得到的白色毛氈狀菌落，挑取生長旺盛的單菌落至新的培養基中，發現菌落在培養基的環境下即可形成子實體原基，如圖2所示，而此現象在多孢分離前的虎奶菇菌種中并未發現，表明虎奶菇經多孢分離后獲得了子實體形成能力強的菌株，孢子萌發率高、多孢融合菌絲的菌落均勻。

以上所述，僅為本發明的較佳的具體實施例，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。