本發明屬于生物制劑技術領域，具體涉及一種細胞保存液及該保存液的制備方法和使用方法。
背景技術：
基因的提取是分子生物學檢驗工作中最基本的應用技術，臨床上常用的方法有碘化鈉法、酚-氯仿法、Chelex-100法和試劑盒法等。上述這些方法大多使用人全血作為基因提取的標本，采樣過程存在一定困難，如采血過程中的安全隱患、血液樣本易遭污染、患者拒絕率較高等問題，同時采取血樣的成本高、操作較為繁瑣，需要具有專業技能的人員進行操作才可靠。因此，探索更為取材簡便、操作便捷，同時易于被患者接收的基因采集方法具有非常重要的意義。口腔黏膜上皮細胞的采集十分簡便快捷，不僅方便易得，而且基本上無創，患者自行操作即可完成。現有技術中，許多醫學領域中人體細胞提取的過程已適用提取口腔細胞進行分析，研究表明，口腔上皮細胞中提取到的DNA數量與質量比較理想，可作為人體細胞分析的樣本進行使用。現有技術中口腔細胞提取的過程為：醫護人員利用專業的口腔拭子在患者頰粘膜兩側輕刮數次，然后將拭子頭置入細胞保存液中，讓拭子頭上留存的患者細胞落入細胞保存液中，然后將含有患者細胞的細胞保存液密封，最后送到各分析中心。
對于如上述非血液途徑獲取的細胞，如何維持細胞活性是一項極大的挑戰，在短時間內保存細胞并在臨床上應用時，往往使用生理鹽水來維持細胞活性，然而細胞在生理鹽水中活性降低的速度非常快，10小時之內細胞的活性喪失率可達30%甚至更高，然而許多對細胞的觀察測試從取樣到應用可能需要超過10小時、24小時，甚至多達數天，生理鹽水無法滿足需求。為了解決這一問題，各類細胞固定液應運而生。細胞保存液是一種能夠幫助細胞保持原有形態、結構的一種化學藥品，其功能是迅速防止細胞死亡后的變化，防止其自溶、腐敗，盡量保持生長狀態結構，同時使細胞中的蛋白質、脂肪、糖、酶等成分轉變為不溶性物質，以保持其生前的形態，進一步地，好的細胞保存液還可使細胞更便于觀察和鑒定。目前市場上有許多不同種類的細胞保存液，不同的廠商擁有自己的保存液配方，許多細胞保存液被用于與測試儀器一同進行銷售，價格昂貴。
技術實現要素：
4%的多聚甲醛細胞保存液是使用較多的細胞保存液之一，具有對組織穿透性好、固定均勻的特性。但是，4%多聚甲醛細胞保存液則對細胞保存的時間非常敏感，超過12h以后其保存的細胞活性往往下降較快。針對4%多聚甲醛細胞保存液無法長時間對細胞進行高效保存的問題，本發明中提供了一種以4%多聚甲醛細胞保存液為基礎的新的細胞保存液，該保存液不僅大幅提升了對細胞保存的時間，而且制備方法簡單、適用范圍廣泛。
本發明的技術效果通過以下技術方案得以實現：
本發明中提供的一種細胞保存液，為超純水配制的溶液，該溶液為多聚甲醛保存液，溶液中還包括如下濃度范圍的組分：
戊二醛 0.4-0.8wt%
枸櫞酸鉀 0.05-0.1mol/L
雙乙酸鈉 0.035-0.15mol/L
六水氯化鎂 0.1-0.3mol/L
氯化鈉 0.08-0.4mol/L
α-硫辛酸 0.003-0.005mol/L
海藻糖 0.08-0.12mol/L
苦參堿 3-5mg/L
上述多聚甲醛保存液的制備方法為：將多聚甲醛溶解于30-40℃氫氧化鈉水溶液中，用超純水定容制成8wt%的多聚甲醛溶液，然后攪拌滴入0.2-0.3%v/v的焦炭酸二乙酯，持續攪拌至溶液清亮，然后加入PB緩沖液至多聚甲醛質量百分含量為4wt%；
所述細胞保存液的pH值為7.1-7.4，滲透壓為290-315mmol/L。
4wt%甲醇溶液對細胞固定效果好，所有的保存液利用超純水進行配制可有效防止雜質離子的進入，在本發明中，所有配制過程中使用的超純水的生產時間不超過12小時，以免超純水變質。在本發明的配方中，枸櫞酸鉀和雙乙酸鈉作為協同防腐抗凝劑進行使用，六水氯化鎂和氯化鈉共同作為緩沖鹽。α-硫辛酸是一種抗氧化劑，在本發明的配方中，與其他添加元素協同使用能夠有效提升長時間保存后的細胞的活性。苦參堿是來自于苦參、山豆根等中藥中的活性成分，是四環喹嗪啶類衍生物，屬于生物堿，現代藥理研究表明，苦參堿具有抗炎、抗病毒、阻斷細胞凋亡、穩定細胞膜等作用。海藻糖作為天然糖類的一種，還能夠起到非滲透性低溫保護劑的作用，海藻糖還是一種非還原性雙糖，具有非常穩定的理化作用，對細胞無任何毒副作用，能夠有效穩定細胞膜和蛋白質結構。將海藻糖和苦參堿這兩種來自于動植物的活性成分加入細胞保存液中，可有效增強了保護作用。同時，為了消除添加的物質對多聚甲醛對細胞固定能力的影響，添加少量戊二醛與之相匹配使用。
在多聚甲醛保存液的制備過程中，發明人發現現有的制備方法中往往直接將多聚甲醛溶于PB緩沖液或者PBS緩沖液中，由于多聚甲醛難溶于水，所以溶解時間非常長并需要輔助進行加熱，往往需要在60℃甚至更高的溫度下溶解4小時以上。考慮到上述制備過程中耗時的問題，本發明利用了多聚甲醛難難溶于水但是在堿溶液中溶解速度加快的特點，首先將多聚甲醛溶解于少量的氫氧化鈉水溶液中，為進一步提升溶解速度，對堿液進行加熱，只需略加熱至30-40℃即可。在溶解多聚甲醛的步驟中，使用的氫氧化鈉水溶液濃度為5-10wt%，溶解時使用的量不宜過多，能夠浸沒多聚甲醛使其快速溶解即可，以免影響保存液整體pH值。多聚甲醛溶解后用超純水定容，然后滴入焦炭酸二乙酯（DEPC），持續攪拌至溶液清亮，最后加入PB緩沖液即可。
本發明中使用PB緩沖液而非PBS緩沖液，其目的是避免引入過多離子，所述PB緩沖液為0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4以體積比1:1.5-4混合配制而成。
進一步地，本發明中細胞保存液還包括0.1-0.2wt/L的氨基酸，所述氨基酸為甘氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸中的一種或多種。氨基酸能夠協同保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞，即延長細胞保存時間。
為保證細胞保存液的純度，本發明細胞保存液中所用原料都為分析純。
本發明中還提供一種制備上述細胞保存液的方法，包括如下步驟：
步驟一：按照保存液配方稱取多聚甲醛保存液及其他原料；
步驟二：將其他原料倒入多聚甲醛保存液中，攪拌均勻，利用0.2mol/L的NaH2PO4和/或0.2mol/L的Na2HPO4將pH值調整至7.1-7.4；
步驟三：將步驟二中制備得到的溶液滅菌，即得到所需細胞保存液。
本發明還提供一種細胞的保存方法，即利用本發明中的細胞保存液密封靜置保存。進一步地，該細胞保存方法尤其適用于對口腔細胞進行保存，保存的細胞濃度為105-108個/ml。
本發明具有如下技術效果：
1、本發明中提供了一種細胞保存時間長、效果好的細胞保存液。
2、本發明中的細胞保存液制備方法簡單、適用范圍廣泛，針對非血液途徑獲取的細胞，能夠在較長時間內有效維持其活性，尤其適用于口腔細胞。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明的內容進行進一步的描述。
1、多聚甲醛保存液的制備
將稱取的多聚甲醛溶解于38℃的5wt%氫氧化鈉水溶液中，然后用超純水定容制成8wt%的多聚甲醛溶液，然后攪拌滴入0.23%v/v的焦炭酸二乙酯，持續攪拌至溶液清亮，然后加入PB緩沖液至多聚甲醛質量百分含量為4wt%。溶解時使用氫氧化鈉溶液的量不宜過多，能夠浸沒多聚甲醛使其快速溶解即可。利用本實施例中多聚甲醛的保存液的制備方法，比直接用PB緩沖液溶解的方法快2個小時。
本實施例中，使用的PB緩沖液為0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4以體積比1:3.6混合配制而成。
本實施例中配置過程使用的水全部為新制備的超純水化學試劑為正規試劑生產廠家生產的分析純試劑。
2、實施例中細胞保存液的制備
多聚甲醛保存液中的添加組分及含量按照下表中的成分含量進行配比：
細胞保存液的制備方法如下：
步驟一：按照保存液配方稱取多聚甲醛保存液及其他原料；
步驟二：將其他原料倒入多聚甲醛保存液中，攪拌均勻，利用0.2mol/L的NaH2PO4和/或0.2mol/L的Na2HPO4將pH值調整至7.1-7.4；
步驟三：將步驟二中制備得到的溶液滅菌，即得到所需細胞保存液。
上述實施例中細胞保存液的滲透壓均在290-315mmol/L范圍內。
3、對比例細胞保存液的制備
4、測試及結果對照
將實施例及對比例中的細胞保存液應用于口腔細胞的保存中。利用同樣的取樣拭子取人體口腔細胞，細胞濃度在3×106-107個/ml范圍內，然后將取樣拭子靜置密封保存于細胞保存液中，將細胞保存液置于4℃環境中靜置密封保存。在保存24h、48h、72h、96h后分別取出細胞，用臺盼藍染色，在顯微鏡下計數觀察存活細胞的數量。
由試驗結果可以看出，由本實施例中的細胞保存液保存細胞平超過4天以后，仍舊有非常高的細胞存活率，而且采用本實施例中提供的細胞保存液進行保存的細胞平均活性下降率低。
最后需要說明的是，以上實施例僅用以說明本發明實施例的技術方案而非對其進行限制，盡管參照較佳實施例對本發明實施例進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明實施例的技術方案進行修改或者等同替換，而這些修改或者等同替換亦不能使修改后的技術方案脫離本發明實施例技術方案的范圍。