石蒜花提取物的制備方法及在制備治療或預(yù)防油茶病害藥物中的用途與流程

本發(fā)明涉及石蒜花提取物的制備方法，具體地指一種石蒜花提取物的制備方法及在制備治療或預(yù)防油茶病害藥物中的用途。

背景技術(shù)：

油茶(Camellia oleifera)是我國特有的一種高級油料作物，與油棕、橄欖和椰子并稱世界四大木本油料樹種，請見(莊瑞林.中國油茶[M].北京：中國林業(yè)出版社，2008.)。油茶的綜合價值很高，茶籽通過壓榨后取得的茶油是深受群眾喜愛的優(yōu)質(zhì)食用油，其不飽和脂肪酸含量90％以上；茶油還能通過深加工生產(chǎn)高級保健食用油、醫(yī)藥和天然化妝品用油等；茶油在工業(yè)上可制取油酸及其酯類，以此為原料生產(chǎn)肥皂和凡士林等，還可經(jīng)極度氫化后水解制硬脂酸和甘油等工業(yè)原材料；另外，茶油還可作為醫(yī)藥原料制作注射用的針劑和調(diào)制各種藥膏、藥丸等，請見(劉躍進(jìn)，歐日明，陳永忠.我國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21(4):1-4.)。因此，油茶的經(jīng)濟(jì)價值非常高，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品及生物化工領(lǐng)域，有著廣闊的國內(nèi)外市場需求。

然而，油茶病害種類繁多，油茶炭疽病、葉枯病、軟腐病、根腐病、茶餅病、黑斑病等在我國各油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，主要引起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干潰瘍、甚至整株死亡，每年油茶產(chǎn)業(yè)因病害造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，請見(束慶龍，張良富.中國油茶栽培與病蟲害防治[M].北京：中國林業(yè)出版社，2009.)。近年來，湖北油茶種植規(guī)模不斷擴大，相應(yīng)的病害逐步引起高度重視。

目前對油茶主要病害的防治普遍通過種植抗性品種和化學(xué)防治來控制，過多使用化學(xué)殺菌劑有危害人類身體健康、藥物殘留破壞生態(tài)環(huán)境、引發(fā)病原物產(chǎn)生抗藥性、影響茶油質(zhì)量和食用安全等諸多缺點，不利于油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。因此，當(dāng)前防治油茶病害的首要任務(wù)是尋求安全、高效和經(jīng)濟(jì)的生物源農(nóng)藥。

國內(nèi)外已有植物提取物抑制植物病害的相關(guān)報道，如張啟東等采用30種藥用植物提取物展開殺蟲殺菌活性研究，結(jié)果表明卡瓦胡椒和厚樸的乙醇提取物對玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌、小麥根腐病菌和油菜菌核病菌具有較高的殺菌活性，請見(張啟東，黃路枝，胡兆農(nóng)，等.30種藥用植物提取物殺蟲殺菌活性研究[J].西北植物學(xué)報，2006(06)：1223-1230.)；汪曉娟等研究了百部堿等5種植物提取物對水霉菌的抑制作用，結(jié)果表明苦楝提取物對水霉菌抑制作用最為明顯，請見(汪曉娟，胡青，林崗.百部堿等5種植物提取物對水霉菌的抑制作用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(上半月刊)，2012(23)：38-42.)；周建宏等采用生長速率法初步篩選了20種植物的水提取物對油茶軟腐病菌、炭疽病菌的生物活性，不同植物提取物的林間防治效果表明：當(dāng)丁香、黃芩提取物及茶皂素的質(zhì)量比為1:1:1時，對油茶主要病害的防治效果最好，可達(dá)80％，同時可以將油茶的病果率降低約60％，請見(周建宏，劉君昂，鄧小軍，等.植物提取物對油茶主要病害的抑菌作用[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2011(04)：42-45.)。周德明等研究了12種植物對油茶炭疽病菌和軟腐病菌的抑制活性，結(jié)果表明博落回的乙醇粗提物對油茶炭疽病、油茶軟腐病的抑制作用最強，其室內(nèi)離體抑菌率分別達(dá)80.87％和61.1％，請見(周德明，艾芹，周國英.12種植物對油茶炭疽病菌和軟腐病菌的抑制活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015(06)：121-123.)。后面2則研究主要針對油茶軟腐病菌和炭疽病菌，其防治范圍還有進(jìn)一步擴大的空間，對油茶病害的防治效果也可進(jìn)一步提高。

石蒜(Lycoris radiate)是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜屬(Lycoris Herb.)草本植物，別名紅花石蒜、龍爪花等，請見(李明凱，張玉瓊，董召榮，等.高效液相色譜法測定石蒜中加蘭他敏、力可拉敏及石蒜堿3種生物堿[J].分析測試學(xué)報，2012，31(8)：957-961.)。石蒜是東亞常見的園林觀賞植物，冬賞其葉，秋賞其花；是優(yōu)良宿根草本花卉，園林中常用作背陰處綠化或林下地被花卉，花鏡叢植或山石間自然式栽植，現(xiàn)人工種植越來越多?；ㄆ谶^后，花瓣枯萎凋謝，不被人們利用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供了一種石蒜花提取物的制備方法，該方法利用凋謝后的石蒜花瓣制得石蒜花提取物，該方法生產(chǎn)簡單，方便易行，適合規(guī)?；a(chǎn)和實際應(yīng)用。制備石蒜花提取物的原料來自于凋謝的石蒜花瓣，生產(chǎn)成本極低，變廢為寶。

本發(fā)明的第二個目的是提供了石蒜花提取物在制備治療或預(yù)防油茶主要病害藥物中的應(yīng)用，該石蒜花提取物作為防治油茶主要病害的生物源殺菌劑，其高效防治油茶炭疽病、葉斑病、黑斑病和潰瘍病，提取物抑菌率實驗表明，該石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率達(dá)到90％以上。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種石蒜花提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)采集已經(jīng)枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，清洗干凈后晾干，

2)將清洗晾干后的花瓣樣品勻漿粉碎，

3)將花瓣與提取溶劑按質(zhì)量體積比1:10～30g/L混合，，浸提24～72h，過濾花瓣雜質(zhì)后即可得到石蒜花提取物，其中，提取溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60～90％的乙醇溶液。

進(jìn)一步地，所述步驟3)中，乙醇溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70～85％。

再進(jìn)一步地，所述花瓣與乙醇質(zhì)量體積比1:15～25g/L。

本發(fā)明還提供了一種上述制備得到石蒜花提取物在制備治療或預(yù)防油茶病害藥物中的應(yīng)用，所述油茶病害為油茶炭疽病、油茶葉斑病、油茶軟腐病、油茶黑斑病或油茶潰瘍病。其應(yīng)用基本過程是：

A、采用濾紙片平板對峙培養(yǎng)法研究石蒜花提取物對油茶主要病害的拮抗作用。準(zhǔn)備好直徑為7mm的濾紙片并滅菌處理，并在石蒜花提取物中浸潤2min；將打好的直徑為7mm的病原菌餅和浸潤后的濾紙片放置在平板中心線上，病原菌餅置于平板中央，浸潤有石蒜花提取物的濾紙片分別距離平板中心1.5cm，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并每隔24h在超凈工作臺中無菌吸取5μL石蒜花提取物浸潤1個濾紙片，5～7天后觀察抑菌帶有無及大小，每個處理重復(fù)3次。

抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

B、采用培養(yǎng)法研究石蒜花提取物對油茶主要病害的拮抗作用。將石蒜花提取物與約50℃的PDA固體培養(yǎng)基按照1:19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7mm的油茶主要病原菌菌餅，以無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次。5天后測量病原菌菌落直徑。

抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了石蒜花提取物對油茶主要病害(如油茶炭疽病、油茶膠孢炭疽病、油茶葉斑病、油茶軟腐病、油茶黑斑病、油茶潰瘍病等)均具有較強的抑制和滅殺活性。抗菌譜廣泛，可有效降低防治成本。

2)石蒜花花期過后，花瓣枯萎凋謝，不被人們利用。本發(fā)明則利用凋謝后的石蒜花瓣制得一種石蒜花提取物，原料成本極低，變廢為寶。

3)本發(fā)明的石蒜花提取物制備方法簡單，效果明顯，彌補了一般化學(xué)藥劑和生物農(nóng)藥防效不顯著的缺陷，更易在實際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

4)本發(fā)明制備的石蒜花提取物殺菌活性成分多樣，可緩解油茶病害致病菌的耐藥性產(chǎn)生，且植物活性成分易代謝，在土壤中無殘留，因此，該生物藥劑產(chǎn)品能長期在某個地區(qū)使用，施用后對人畜無毒害，環(huán)境友好。

5)本發(fā)明利用培養(yǎng)法實驗抑菌率表明：該石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率達(dá)到90％以上。

附圖說明

圖1為時間對石蒜花提取物對油茶膠孢炭疽病拮抗效果的影響示意圖。

圖2為溫度對石蒜花提取物對油茶膠孢炭疽病拮抗效果的影響示意圖。

圖3為石蒜花提取物對油茶黑斑病原菌的拮抗效果示意圖。

具體實施方式

為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實施例。

本發(fā)明所用的試劑或原料，均購自商業(yè)渠道。

菌株來源：油茶炭疽病Colletotrichum nicotianae同文獻(xiàn)中報道菌株(李東升，張一揚.煙草炭疽病的形態(tài)特征和致病性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(5)：97-98.)；油茶膠胞炭疽病Colletotrichum.gloeosporioides，同文獻(xiàn)中報道菌株(孟慶敏，周國英，劉君昂，等.油茶炭疽病拮抗細(xì)菌Y13主要抑菌物質(zhì)分離純化及作用方式[J].植物保護(hù)，2014，40(2)：36-42.)；油茶葉斑病Phyllosticta capitalensis，同文獻(xiàn)中報道菌株(馬成,彭麗娟,吳石平.銀杏葉點霉葉斑病病原菌鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(12):126-128.)；油茶軟腐病Agaricodochium camellia，同文獻(xiàn)中報道菌株(趙丹陽,秦長生,廖仿炎.5種殺菌劑對油茶軟腐病的防治研究[J].廣東林業(yè)科技,2013,29(2):28-31.)；油茶黑斑病Altermaria alternate同文獻(xiàn)中報道菌株(Kobiler I,Akerman M,Huberman L,et al.采前與采后處理結(jié)合控制柿子貯藏過程中鏈格孢菌(Alternaria alternata)引起的黑斑病的研究[J].保鮮與加工,2011,5:025.)，油茶潰瘍病Bothyosphaeria dothidea，同文獻(xiàn)中報道菌株(Slippers B,Crous P W,Denman S,et al.Combined multiple gene genealogies and phenotypic characters differentiate several species previously identified as Botryosphaeria dothidea[J].Mycologia,2004,96(1):83-101.)。

實施例1

石蒜花提取物1的制備方法，其步驟是：

1)采集已經(jīng)枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，自來水清洗干凈后晾干，

2)利用勻漿機將清洗晾干后的花瓣樣品勻漿粉碎，按照質(zhì)量體積比1：10g/L將花瓣和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90％的乙醇溶液混合，浸提24h，過濾花瓣雜質(zhì)后即得到石蒜花提取物1，4℃短期保藏。

實施例2

石蒜花提取物2的制備方法，其步驟是：

1)采集已經(jīng)枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，自來水清洗干凈后晾干，

2)利用勻漿機將清洗晾干后的花瓣樣品粉碎，按照質(zhì)量體積比1：20g/L將花瓣和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的乙醇溶液混合，浸提72h，過濾花瓣雜質(zhì)后即得到石蒜花提取物2，4℃短期保藏。

實施例3

石蒜花提取物3的制備方法，其步驟是：

1)采集已經(jīng)枯萎或者凋謝的石蒜花瓣，自來水清洗干凈后晾干，

2)利用勻漿機將清洗晾干后的花瓣樣品粉碎，按照質(zhì)量體積比1：15g/L將花瓣和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％的乙醇溶液混合，浸提48h，過濾花瓣雜質(zhì)后即得到石蒜花提取物3，4℃短期保藏。

實施例4

一種石蒜花提取物在制備治療或預(yù)防六種油茶病原菌藥物中的應(yīng)用，其步驟是：

A.蒜花提取物與多種油茶病原菌體外互作：采用平板對峙培養(yǎng)法：準(zhǔn)備好直徑為7mm的濾紙片并滅菌處理，并在石蒜花提取物中浸潤2min；將打好的直徑為7mm的病原菌餅和浸潤后的濾紙片放置在平板中心線上，病原菌餅置于平板中央，浸潤有石蒜花提取物的濾紙片分別距離平板中心1.5cm，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并每隔24h在超凈工作臺中無菌吸取5μL石蒜花提取物浸潤1個濾紙片，5-7天后觀察抑菌帶有無及大小，每個處理重復(fù)3次。結(jié)果見表1。

結(jié)果表明石蒜花提取物對油茶炭疽病、膠孢炭疽病、葉斑病、軟腐病、黑斑病和潰瘍病均有很好的拮抗作用，抑菌率均達(dá)到90％以上。

表1石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(下同)，

抑菌率＝(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

B、采用培養(yǎng)法。將石蒜花提取物與約50℃的PDA固體培養(yǎng)基按照1:19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7mm的油茶主要病原菌菌餅，以無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次。5天后測量病原菌菌落直徑。

抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。

表2同樣顯示石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率均達(dá)到90％以上，尤其是對黑斑病的抑菌率達(dá)到99.6％，如圖3所示，系列結(jié)果表明石蒜花提取物抗菌譜廣，抑菌效果顯著。A中培養(yǎng)基未添加石蒜花提取物，病原菌生長快速，菌落直徑達(dá)到62.8±0.8mm，而B中培養(yǎng)基添加石蒜花提取物后，幾乎完全抑制了病原菌的生長，抑菌效果顯著。

表2石蒜花提取物對油茶主要病害的抑菌率

實施例3

石蒜花提取物在制備治療或預(yù)防馬鈴薯干腐病和睡蓮黑斑病病原菌藥物中的應(yīng)用，采用培養(yǎng)法步驟是：

將石蒜花提取物與約50℃的PDA固體培養(yǎng)基按照1:19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央分別放入直徑為7mm的馬鈴薯干腐病和睡蓮黑斑病菌餅，以無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次。5天后測量病原菌菌落直徑。抑菌率＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7)×100％。表3顯示石蒜花提取物對馬鈴薯干腐病和睡蓮黑斑病原菌的抑菌率超過50％，該提取物的抑菌譜較廣。

表3石蒜花提取物對瑪咖根腐病和睡蓮黑斑病病原菌的抑菌率

實施例4

石蒜花提取物抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測試

時間穩(wěn)定性測試：按照提取方法制備好石蒜花提取液，分別在4℃下放置0d、10d、20d、30d、40d、50d、60d測試其對油茶膠胞炭疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的抑制作用。每個處理重復(fù)3次。對油茶炭膠胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的拮抗效果如圖1所示。結(jié)果顯示該提取物對油茶膠孢炭疽病拮抗效果隨時間的增加而減弱，且在40天范圍內(nèi)略微降低，第60天后，抑菌活性降低幅度變大，說明該提取物中有效成分能保留較長時間，但最好在該提取物活性較強的期限40天內(nèi)使用。

溫度穩(wěn)定性測試：按照提取方法制備好石蒜花提取液，各取5mL轉(zhuǎn)入無菌試管中，分別在溫度為20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下處理2h，測試其對油茶炭膠胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的抑制作用。每個處理重復(fù)3次。對油茶炭膠胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的拮抗效果如圖2所示。結(jié)果表明該石蒜花提取物在40℃時拮抗效果最佳，且在當(dāng)溫度高于80℃時，抑菌活性逐漸降低，說明該提取物中有效成分部分耐高溫能力較強，部分有效成分不能耐高溫。

其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據(jù)本實施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。