1.一種越橘植物種質的超低溫保存方法,其特征在于,它包括:
1)煉苗:選取4周苗齡的組培苗,取0.4-0.6 cm帶有頂芽的莖段接種到WPM培養基上4℃暗處理2—4周;
2)越橘莖尖剝取:在無菌條件下,在體視顯微鏡下剝取煉苗后的頂芽,莖尖長為1.5—2.0mm;
3)預培養:將剝取的莖尖接種于添加有0.3M蔗糖的WPM固體培養上,于組培室黑暗培養18—30h;
4)裝載:將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中,于室溫下裝載處理20-40min;
5)玻璃化處理:將裝載處理后的莖尖轉接于PVS2溶液中,于0℃處理30-50min;
6)小液滴制作:將PVS2處理后的莖尖轉移到鋁箔條上 ,并向每個莖尖滴加6μLPVS2溶液,使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中,每個錫箔條上放9-11個莖尖;
7)超低溫冷凍保存:將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進行冷凍,然后將冷凍后的錫箔條置于冷凍離心管中,蓋緊蓋子后,投入液氮中保存。
2. 根據權利要求1所述的越橘植物種質的超低溫保存方法,其特征在于:步驟1) 所述的的煉苗時間為3周,步驟3)所述的預培養時間為24h時。
3.根據權利要求1或2所述的越橘植物種質的超低溫保存方法,其特征在于:步驟4)中所述的裝載液的組成為:WPM+2M甘油+1.0M蔗糖,裝載時間為30min。
4.根據權利要求3所述的越橘植物種質的超低溫保存方法,其特征在于:步驟5)所述的PVS2溶液的組成為:WPM+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4M蔗糖;處理時間為40min時。
5.超低溫保存越橘植物種質恢復培養的方法,其特征在于,它還包括:
1)卸載:將權利要求1所述的一種越橘植物種質的超低溫保存方法的步驟7)超低溫冷凍保存的離體莖尖取出,放置于卸載液中進行解凍和卸載;所述的卸載液的組分為:WPM+1.2M蔗糖;卸載條件為:室溫下卸載20min;
2)恢復培養:將卸載處理后的離體莖尖用無菌濾紙吸干表面殘留液,轉接于恢復培養基中進行恢復培養;前述的方法,恢復培養基為WPM+0-0.5mg/L ZT +3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH=5.8;恢復培養條件為:組培室黑暗培養 1d ,最后轉至正常光照條件下進行培養。