一種抗根腫病的甘藍?大白菜遠緣雜種的創制方法與流程

本發明屬于生物技術育種領域，涉及一種抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種的創制方法。

背景技術：

根腫病是由根腫菌屬蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的、危害十字花科作物的一種傳染性非常強的土壤病害，結球甘藍(Brassica oleracea L.Var.Capitata,，2n＝2x＝CC＝18，簡稱甘藍)是受其危害嚴重的寄主之一；目前生產上非常缺乏抗根腫病甘藍品種。甘藍對根腫病抗性屬于數量性狀遺傳，由多基因控制，易受環境影響；而且主要是隱性基因，這就使得利用常規育種方法改良甘藍根腫病抗性存在困難并且進展緩慢。國內外對大白菜抗根腫病的研究表明，大白菜對根腫病菌的侵染大多表現受顯性單基因控制。其中位于A3連鎖群的CRb基因對根腫菌生理小種2、4和8表現抗性，是一個優良的抗性基因。

技術實現要素：

本發明的目的是針對目前甘藍資源遺傳基礎狹窄，抗根腫病資源缺乏這一現狀，提供一套利用胚胎拯救獲得甘藍-大白菜遠緣雜種的方法，創造一批抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種；同時為擴大甘藍基因庫，引進近緣種中優異的目標性狀(基因)，形成一套甘藍品種改良的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種的創制方法，包括以下步驟：

(1)授粉方法：以抗根腫病大白菜為母本，甘藍為父本，配置雜交組合,采用人工剝蕾去雄重復授粉的方法，取父本新鮮花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱頭上；

(2)胚珠培養：取授粉后10d的子房消毒滅菌，剝取子房中的胚珠接種到胚挽救培養基上,在環境25±0.5℃，光照強度50-100μmol·m^–2·s^–1，光照時長12-14h·d^–1條件下培養25～30d，所述的胚挽救培養基為：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(3)分化培養：待幼胚長至子葉形胚時，接入分化培養基誘導不定芽分化，所述的分化培養基為：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(4)繼代培養：20～30d后轉入繼代培養，繼代培養基為：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.90～5.95；

(5)生根培養：繼代2周后接入生根培養基誘導生根，所述的生根培養基為：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.90～5.95；

(6)人工加倍：將修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中進行加倍，所述的處理條件為含2％二甲基亞砜濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理18-20h，處理完畢后，將根部的秋水仙素殘液沖洗干凈，最后定植于含有草炭土、珍珠巖和蛭石的穴盤中；

(7)形態學鑒定：對幼苗營養生長階段、生殖生長階段的主要形態特征進行觀察；

(8)細胞DNA相對含量測定：用流式細胞儀對后代加倍植株進行細胞DNA相對含量測定；

(9)根腫病抗性鑒定：通過菌土法接種鑒定和抗根腫病基因CRb的分子標記驗證相結合鑒定根腫病抗性，將基質滅菌后，每克滅菌土中接種0.001g病根，然后直接將鑒定材料播于菌土中，于25-28℃下培養，2個月后拔出幼苗，洗凈根部雜質，觀察發病情況；同時，利用與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13對后代植株進行分子標記鑒定，當后代材料的擴增譜帶中出現抗根腫病大白菜所具有的特異條帶時，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

其中，步驟(1)中所述的雜交組合的配置為：抗根腫病大白菜為母本，甘藍為父本。其中母本為引進的1份對根腫病表現免疫、攜帶CRb基因的大白菜材料。

步驟(2)中子房消毒滅菌方法為：用75％(體積分數)的乙醇消毒1min，然后用7％(體積分數)的次氯酸鈉滅菌15min，再用用無菌水沖洗3次，每次5min。

步驟(6)中秋水仙素溶液進行加倍處理時一定要沒過根部。

步驟(6)中草炭土、珍珠巖和蛭石的體積比為8:1:1。

步驟(9)中所述的與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13上游引物序列為TGTTGATTGTGGATTTTTGTGA(SEQ ID NO.1)，下游引物序列為CCAAACTAGCCAATAACCATTGTA(SEQ ID NO.2)。

步驟(9)中當后代材料的擴增譜帶中出現抗根腫病大白菜所具有的313bp特異條帶時，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

有益效果

本發明利用抗根腫病大白菜和甘藍為材料，采用幼胚拯救技術進行甘藍抗性改良，促進大白菜與甘藍之間的遺傳雜交，合并兩個種的優異基因，獲得了一批優異的種間新種質，為進一步漸滲轉移利用抗根腫病基因、改良甘藍品種奠定基礎。本發明提供的一種大白菜與甘藍遠緣雜交新種質創制方法，與現有技術相比具有如下優點和積極效果：

(1)本發明利用的是攜帶CRb基因的大白菜抗源，經鑒定其對根腫病抗性達免疫水平，是一個非常理想的抗源材料。

(2)本發明在胚挽救的MS培養基添加了0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白，提高了胚胎拯救率和誘導率。

(3)本發明在人工加倍中使用的處理是含2％二甲基亞砜(DMSO)濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理18h，提高了種間雜種的加倍率。

附圖說明

圖1遠緣雜種F₁形態學鑒定。

(a)甘藍(左)、雜種F₁(中)、大白菜(右)營養生長期表型；(b)甘藍(左)、雜種F₁(中)、大白菜(右)生殖生長期表型；(c)甘藍(左)、雜種F₁(中)、大白菜(右)種子表型；

圖2引物TCR13對遠緣雜種F₁鑒定的擴增結果

1-4為母本大白菜，5-10和13-17攜帶CRb基因的真雜種，11-12為假雜種，18-19為父本甘藍。箭頭所示為與CRb基因連鎖的抗病帶型

具體實施方案

本發明所提供的一種抗根腫病的甘藍-大白菜遠緣雜種的創制方法，通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容不局限于此：

1.甘藍-大白菜種間雜交后代材料的獲得

1.1材料選擇

甘藍為不同基因型的二倍體高代純合材料，大白菜為抗根腫病的二倍體材料。

1.2幼胚拯救及雜種獲得

(1)授粉方法：于塑料大棚內進行雜交，甘藍和大白菜互為父母本進行雜交，在母本開花前1～2d剝蕾去雄,授以父本的花粉,套袋隔離。次日開始采用重復授粉法進行人工授粉(每天授粉一次，重復三次)。結果表明，以大白菜為母本的幼胚拯救率高于以甘藍為母本。

(2)幼胚拯救：取授粉后7d、10d、12d的子房,用75％(體積分數)的乙醇消毒1min，然后用7％(體積分數)的次氯酸鈉滅菌15min，再用用無菌水沖洗3次，每次5min。剝取子房中的胚珠接種到胚挽救培養基上在環境溫度25±0.5℃，光照強度75μmol·m^–2·s^–1，光照時長14h的條件下培養28d。所述的胚挽救培養基處理為：0(CK，MS+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95)、添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA、添加0.6g/L水解酪蛋白、添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白。結果表明,授粉后10d的子房，在MS培養基中添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白,pH為5.95時獲得了最高的誘導率。

(3)分化培養：待幼胚長至子葉形胚時，接入分化培養基誘導不定芽分化，所述的分化培養基為：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.95。

(4)繼代培養：25d后轉入繼代培養，繼代培養基為MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95。

(5)生根培養：繼代2周后接入生根培養基誘導生根，所述的生根培養基為：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.95。

(6)利用秋水仙素進行人工染色體加倍

先將待處理的植株從生根培養基中取出，于自來水管下將根部沖洗干凈，用剪子將根剪至1～2cm長，然后將修剪好的植株根部浸泡在配制的含2％二甲基亞砜(DMSO)濃度為0.4％的秋水仙素溶液中處理(秋水仙素溶液一定要沒過根部)。每個處理4～5棵植株。處理時間為12h、18h、24h、30h。將處理的植株置于25℃、通風、光照條件下。結果表明，當處理時間為18h的時候，植株加倍率最高。處理完畢后，將植株從秋水仙素溶液中取走，于自來水管下將根部的秋水仙素的殘液沖洗干凈。最后定植于含有草炭土、珍珠巖和蛭石(8:1:1)的穴盤中。當植株長到4～5片葉后移栽到大田。

2.種間雙二倍體雜種的鑒定

(1)形態學鑒定從F₁出苗至開花、結籽，對其主要形態特征進行觀察并拍照，結果發現：F₁營養生長階段的生長形態為生長勢大于雙親，綜合性狀介于雙親之間；抽薹始期與大白菜相近，種株整個生長形態介于雙親之間，生長勢大于雙親。自交授粉后收獲的種子獲得的種子黑褐色，比雙親的種子大，整體性狀具有超親優勢。

(2)DNA相對含量的分析：用流式細胞儀對雙親和經形態學鑒定為遠緣雜交種的F₁的葉片細胞DNA相對含量進行了定和比較。結果表明，雙親大白菜、甘藍二倍體植株的細胞DNA高峰值均出現在橫坐標200的相對位置上，而獲得的后代植株的細胞DNA高峰值則均出現在400的相對位置上，這表明后代加倍植株的細胞DNA相對含量較其二倍體親本增加了一倍，即后代植株的染色體已進行了加倍。

(3)根腫病抗性鑒定：通過菌土法接種鑒定和抗根腫病基因CRb的分子標記驗證相結合鑒定根腫病抗性。將基質滅菌后，每克滅菌土中接種0.001g病根，然后直接將鑒定材料播于菌土中，于25-28℃下培養，2個月后拔出幼苗，洗凈根部雜質，觀察發病情況。同時，利用與大白菜抗根腫病CRb基因緊密連鎖的SSR引物TCR13對后代加倍雙二倍體植株進行分子標記鑒定。提取父母本及后代材料的DNA，然后進行經PCR擴增及6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離獲得擴增譜帶。當后代材料的擴增譜帶中出現抗根腫病大白菜所具有的313bp特異條帶時，即可判定其為攜帶CRb基因的真雜種。

綜上所述，在大白菜和甘藍進行雜交時，最好以大白菜為母本；在對授粉后10d的子房進行消毒后，將胚珠置于為：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95中進行培養；待幼胚長至子葉形胚時，接入MS+0.1mg/L NAA+1mg/L6-BA+6g/L瓊脂+28g/L蔗糖，pH為5.95。分化培養基中誘導不定芽分化；20-30d后轉入MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖，pH為5.95的繼代培養基中繼代培養；繼代2周后接入1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L瓊脂，pH為5.95。生根培養基誘導生根；出苗前，將植株在秋水仙素濃度為0.4％的條件下處理18h進行人工加倍，然后使用形態學特征、流式細胞儀和根腫病抗性對其雜種進一步鑒定。

<110> 江蘇省農業科學院

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TCR13上游引物序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TCR13下游引物序列

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