魚藤酮在抑制輪蟲產卵中的用途的制作方法

本發明屬于微藻養殖領域，尤其是微藻養殖中病蟲害的防治技術。

背景技術：

微藻是一類單細胞植物，廣泛存在于各類水體。微藻富含蛋白質、脂肪和碳水化合物，其代謝產物附加值高，可應用于食品，醫藥、保健、能源等領域。其主要特點包括具有光合效率高，生長速率快，可利用海水或堿水培養，不與農作物爭水爭地等。很多微藻細胞內含有大量油脂，油脂提取后經轉酯化后可獲得生物柴油，生物柴油是解決能源危機的一個重要途徑，可用于取代目前所用的液體燃料。但是自然界很難得到大量的微藻生物量，因此如何獲得大量的微藻，如何有效地規模化培養微藻是未來全球生物能源產業的一個主要突破點。

隨著工業化培養規模的逐級擴大，敵害生物的控制并不能像實驗室無菌環境下那樣精確有效。在制約微藻大規模培養的敵害生物中，浮游動物輪蟲對藻類的攝食危害最為嚴重。每個輪蟲每天可攝食數以萬計的藻細胞，當輪蟲密度達到100尾/ml或更大時，即使培養液中藻細胞濃度很高，也會在短時間內被輪蟲全部吃光。同時，輪蟲的吞噬活動也在培養水體中形成大量的細菌-微藻絮凝體，引起水體進一步惡化，輪蟲繁殖具有世代交替現象，環境條件適宜的時候進行孤雌生殖大量擴大種群數量，環境不適宜的時候迅速形成休眠卵，抵御不良環境。

一般來說，控制輪蟲的方法有物理法(過濾法、紫外線照射、超聲處理)、化學防治法，生物控制法等。在微藻工業化培養中，一般采用紫外法、臭氧法或5％有效氯的次氯酸鈉對培養水體進行前期預消毒1-2天，然后沖洗干凈加入新鮮培養液進行生產。該方法可有效清除輪蟲存活個體，但對大多數輪蟲休眠卵的滅活率比較低。在實施過程中一旦休眠卵殘存下來，對微藻的培養仍會造成爆發性危害。過濾法僅能濾除體型較大的輪蟲成體(>200μm)，對于輪蟲幼體或輪蟲卵難以去除，且過濾速度很慢，耗費時間長，尚不能與目前的光生物反應器結合起來用于藻的規模化培養。化學防治對輪蟲確有殺滅效果，但是對于藻的生長繁殖和生理活性也會產生抑制或毒性作用，因此其應用受到相當大的局限。

魚藤酮是一種從豆科魚藤屬植物種子、塊根中發現的植物衍生物，具有廣譜殺蟲作用。已有研究表明其作用機理是進入蟲體抑制線粒體呼吸鏈，導致害蟲出現呼吸困難和驚厥等呼吸體統障礙，行動遲緩，麻痹而死。魚藤酮具有環境低毒性，它比市售很多其他殺蟲劑毒性要低很多，對魚和害蟲有劇毒，但是對人安全，其原因是魚藤酮是親脂性物質，很容易進入昆蟲氣管和魚的鰓部，造成毒害，而不易通過人的皮膚進入人體，因此對人安全無害。

Agbon等研究發現魚藤酮對臂尾屬輪蟲48小時內的半致死濃度為2.89ppm，此濃度雖然對藻類沒有影響，但其施用濃度較高，且需要在微藻養殖的過程中，使藻液中始終保持一定濃度的魚藤酮，未明確魚藤酮添加的次數和頻率，也就是說魚藤酮的添加很可能是一個持續的過程，因此使輪蟲的防治成本較高。更重要的是，魚藤酮始終屬于一種毒性藥物，盡管對人體無害，仍會對環境中其他生物產生毒性，例如，水蚤48小時半致死濃度為1.04ppm，而利用魚藤酮0.025mg/L就可把魚毒死。為了避免大量毒性物質排放到自然環境中累積造成生物生態環境失衡，破壞魚類水產養殖環境，十分有必要減少其施用的量，包括施用的頻率和濃度。這對微藻的大規模養殖中的病蟲害防治具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種微藻大規模養殖中輪蟲的防治方法，該方法更具有經濟性，在一定程度上減少微藻養殖的病蟲害防治成本，同時減少毒性物質在自然環境中的排放和積累。

本發明的另一目的是提供魚藤酮在抑制輪蟲產卵中的用途，該用途為魚藤酮控制輪蟲提供了一種新的思路和方法。

本發明在研究中發現，魚藤酮對抑制輪蟲的產卵率有極佳的效果，極低劑量的魚藤酮可以大量降低輪蟲的產卵率。因而本發明提出一種新的微藻養殖中輪蟲防治的思路，不僅可有效減少魚藤酮的使用量，還可以將微藻大規模培養中輪蟲的爆發控制達到相當程度，保證大微藻規模培養的順利進行。

經過研究摸索，輪蟲種群的增長一般在第三天種群到達穩定期，此時輪蟲抱卵率開始大量增加，輪蟲卵和種群峰值具有同時出現的趨勢(Edmondson 1965)。本發明的方案主要是在輪蟲大量產卵之前，一次性加入低劑量的魚藤酮試劑，從而抑制輪蟲卵的產生，控制輪蟲種群的數量。輪蟲的抱卵率又叫懷卵率，在顯微鏡下可以觀察輪蟲體內有卵。

本發明的一種微藻養殖中輪蟲的防治方法，其包括：

通過監測輪蟲，在輪蟲大規模產卵之前，一次性向微藻培養體系中加入魚藤酮，使微藻培養體系中魚藤酮的濃度達到0.5-2ppm。

所述監測是在顯微鏡下觀察，當輪蟲的抱卵率達到50％時，標志著輪蟲即將進行大規模產卵。

其中，在微藻養殖過程中，通過檢測微藻培養體系感染輪蟲的狀態，自發現存在輪蟲感染情況開始至第三天，向微藻養殖培養體系中加入魚藤酮。

經實驗驗證：24h內，輪蟲卵(特指可發育成成蟲的受精卵)的數量減少70.1％—91.9％；96h內，由于輪蟲卵的數量被抑制，微藻培養體系中輪蟲活體數量減少37.0％—75.6％。

其中，用到的魚藤酮為市售魚藤酮制劑，魚藤酮質量百分含量7.5％，購自廣州多宇生物科技有限公司。

本發明的技術效果：

本發明減少了魚藤酮在控制微藻養殖過程中的施用量和施用頻次，僅在輪蟲的成蟲進行大量產卵之前，向培養微藻的藻液中加入一定低劑量的魚藤酮，利用其低劑量時對輪蟲的產卵率有顯著滅殺的作用，控制輪蟲種群數量，使微藻免受輪蟲侵害。同時實驗還證明，該可抑制輪蟲產卵的低濃度魚藤酮對微藻的正常生長不產生影響。本發明適用于大規模微藻的培養，在輪蟲污染早期可對輪蟲的種群數量進行有效控制。特別是對于微藻的大規模水體養殖環境來說，魚藤酮在施用濃度和頻次上的減少，能大幅減少魚藤酮隨著藻液排放對環境的影響和微藻養殖的病蟲害控制成本。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為魚藤酮的施用濃度0-2ppm時輪蟲卵數量隨時間的變化情況。

圖2為魚藤酮的施用濃度0-2ppm時輪蟲成蟲數量隨時間的變化情況。

圖3為魚藤酮的施用濃度0-15ppm時柵藻在顯微鏡下觀察的柵藻細胞形態變化。

圖4為魚藤酮的施用濃度0-15ppm時柵藻隨培養天數的生長情況。

圖5為魚藤酮的施用濃度0.5ppm時輪蟲在顯微鏡下觀察的輪蟲皺縮狀態。

具體實施方式

以上所述的具體實施方式，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施方式而已，并不用于限定本發明的保護范圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

實施例1:低濃度魚藤酮對輪蟲成蟲和輪蟲卵的影響實驗

在12L平板反應器培養中發現輪蟲污染，在發現輪蟲的第三天(抱卵率達到≥50％以上，標志著輪蟲將大量產卵)，分別取100ml培養液到12個250ml三角瓶中，隨機分成4組，每組3個重復。每個實驗組添加不同濃度的魚藤酮，分別為0ppm，0.5ppm，1ppm和2ppm，在20℃室溫，45μmol photons·m^-2·s^-1的光照條件下振蕩培養。每隔24h在每個三角瓶中取樣2ml，用1％魯戈式碘液固定，在倒置顯微鏡(奧林巴斯，型號BX41)下用100μL浮游動物計數框統計輪蟲和輪蟲卵的數量，每個樣品三次重復計數。

結果如圖1、2所示：在魚藤酮濃度為0-2ppm范圍內，在顯微鏡下觀察，輪蟲卵數量在24h之內迅速下降(如圖1)，而輪蟲成蟲數量在96小時之內也產生跟隨性下降，成蟲數量在24h幾無減少(如圖2)。在96h以后，輪蟲種群得到有效控制。由于蟲卵的數量迅速下降，而成蟲因壽命較短也開始自然死亡，從而實現藻液中輪蟲數量的控制，使微藻免受輪蟲爆發而受侵害。

實施例2：魚藤酮使用對柵藻生長的影響實驗

魚藤酮對柵藻生長的影響實驗：在1L柱式反應器中培養柵藻，實驗分為5組，每組3個重復，每個反應器最初接種相同量的柵藻，干重為0.8克每升，培養基為BG-11。每組分別加入魚藤酮，控制其有效濃度分別為0、1.5、3、7.5、15ppm。在20℃室溫，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照條件下通氣培養，通入CO₂的量為2％。每隔24h在每個柱式反應器中取樣20ml，在顯微鏡(奧林巴斯，型號BX53)下觀察柵藻活體細胞的狀態以及拍照比較(如圖3)。取10ml用干燥的GF/C膜過濾，測定柵藻每日干重，柵藻生長狀態隨培養天數變化圖，如圖4。結果顯示，再魚藤酮濃度為0-15ppm的范圍內，對柵藻的正常生長沒有影響。

實施例3

在12L平板式反應器培養柵藻過程中發現輪蟲污染，培養條件為20℃室溫，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照條件下通氣培養，通入CO₂的量為2％，培養基為BG-11。在顯微鏡連續觀察的第三天，此時顯微鏡下觀察發現輪蟲抱卵率≥50％，立刻一次性添加魚藤酮至濃度為0.5ppm。經過24小時，輪蟲卵的減少率為74.5％，經過96小時，輪蟲成蟲自然減少率達37.0％，但是輪蟲大部分為皺縮狀態(如圖5)，攝食運動減少，此時不對微藻構成危險。相較于文獻記載的48小時的半致死濃度為2.89ppm(Agbon，2004)，本實施例中魚藤酮的使用量減少82.7％，即可達到相當的控制效果。

實施例4

在12L平板式反應器培養柵藻過程中發現輪蟲污染，培養條件為20℃室溫，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照條件下通氣培養，通入CO₂的量為2％，培養基為BG-11。在顯微鏡連續觀察的第三天，此時顯微鏡下觀察發現輪蟲抱卵率≥50％，立即加入魚藤酮進行控制，一次添加魚藤酮試劑至柵藻培養體系中，使魚藤酮濃度為1ppm。經過24小時，輪蟲卵的減少量為87.2％，經過96小時，輪蟲成蟲自然減少量達41.4％，但是輪蟲大部分為皺縮狀態，攝食運動減少，此時幾乎不對微藻構成危險。相較于文獻記載的48小時的半致死濃度為2.89ppm(Agbon，2004)，本實施例魚藤酮用量減少65.4％。

實施例5

在12L平板式反應器培養柵藻過程中發現輪蟲污染，培養條件為20℃室溫，165μmol photons·m^-2·s^-1的光照條件下通氣培養，通入CO₂的量為2％，培養基為BG-11。在連續觀察的第三天，輪蟲產卵率顯著增長之前(此時顯微鏡下觀察發現輪蟲抱卵率≥50％)，加入魚藤酮進行控制，一次添加至柵藻培養體系中魚藤酮濃度達2ppm。經過24小時，在顯微鏡下觀察輪蟲卵的減少率為91.9％；經過96小時，輪蟲成蟲自然減少率達75.6％。相較于文獻記載的48小時的半致死濃度為2.89ppm(Agbon，2004)，本實施例魚藤酮用量減少30.8％，即可達到相當的控制效果。

實施例6

在420L管道式光生物反應器培養柵藻過程中發現輪蟲污染，培養條件為20℃室溫，140μmol photons·m^-2·s^-1的光照條件下通氣培養，控制pH在6.5-7.0，培養基為BG-11。在連續觀察的第三天，輪蟲產卵率顯著增長之前(此時顯微鏡下觀察發現輪蟲抱卵率≥50％)，加入魚藤酮進行控制，一次添加至柵藻培養體系中魚藤酮濃度達2ppm。經過24小時，輪蟲卵的減少率為92.3％；經過96小時，輪蟲成蟲的減少率為74.4％。根據文獻提供量2.89ppm(Agbon，2004)，此次減少用量30.8％，達到更好的控制效果。

實施例7

在室外520L跑道池光生物反應器培養柵藻過程中發現輪蟲污染，培養條件為室溫，自然光照，通入CO₂量為1-2升每分鐘，控制pH在6.5-7.0，培養基為BG-11。在連續觀察的第三天，輪蟲產卵率顯著增長之前(此時顯微鏡下觀察發現輪蟲抱卵率≥50％)，加入魚藤酮進行控制，一次添加至柵藻培養體系中魚藤酮濃度達2ppm。經過24小時，輪蟲卵的減少率為70.1％；經過96小時，輪蟲成蟲的減少率為63.0％。根據文獻提供量2.89ppm(Agbon，2004)，此次減少用量30.8％，達到更好的控制效果。