本發明涉及組織培養，具體是一種食用土當歸種苗的組織培養方法。
背景技術：
食用土當歸是一種多年生草本植物，為藥食兩用的傳統中藥，其嫩莖葉可做菜食用，可炒食、涼拌或腌食；其根及根莖做九眼獨活入藥，具有祛風活血、解熱鎮痛、利尿消腫、疏風補虛的功效，用于風濕痹痕、腰膝酸軟、頭痛目眩、水腫等癥。當前，食用土當歸的地上部分是國內、國際市場最緊俏的野生綠色蔬菜之一，具有較大的經濟價值，但是其野生資源遭到掠奪式采集，加上其自身內在因素的影響，其生長大面積大幅減少。
通常情況下，土當歸的種植周期一般為2年，第一年的3月直接栽培，十月下旬收獲肉質根作為藥用，選擇留種母根貯藏，次年的3～4月份移栽定植，當年的7～8月份留種母株開花結實，11月份采收，采用上述傳統的種植方法種植的土當歸，生產周期長，人力、物力、財力的投資成本高，并且有將近15～25%的植株容易早抽薹造成產量和質量的下降，并且，隨著種植面積的逐步擴大，病蟲害也逐步加重，輕者影響土當歸的產量和質量，重者絕收，造成重大的經濟損失。
土當歸一般是單株增殖，但一年只增殖5-6倍，種植戶必須把耕地面積的五分之一用于采收種苗，即使有新品種供應，為了增殖也需要很多時間和場地。
為了適應市場需求，擴大食用土當歸種植面積，提高產量水平，增加經濟效益，廣西資源縣銀竹老山中草藥種植專業合作社進行了食用土當歸種苗的組織培養，利用土當歸的葉片為外植體建立其快速繁殖技術，為該物種的資源保護和可持續開發利用奠定基礎。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種利用食用土當歸的葉片為外植體，組織培養其種苗的方法，克服現有土當歸的種植生產周期長，成本高等不足。
本發明一種食用土當歸種苗的組織培養方法，包括如下步驟：
（1）外植體處理：取土當歸葉片為外植體，用清水洗去其表面的塵土，于70%酒精浸泡20-30s，無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，再用無菌水沖洗3~5次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分；
（2）外植體的初代培養：將處理后的外植體用解剖刀切成1.0cm×1.0cm的小塊，接種于MS+TDZ0~0.1mg/L +6-BA0.1~0.5mg/L+NAA0.05~0.5mg/L + 蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L， pH5.8的培養基中，初代培養50天，培養溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000~3000lx；
（3）繼代培養：經初代培養后，葉片邊緣誘導產生大量小苗，將小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，pH5.8的培養基中培養，培養溫度25±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000~3000lx；繼代3天開始有根發生，培養35~40天長成完整健壯小苗，株高2-3cm，根的數目為8-20根；
（4）煉苗與移栽：待土當歸小苗株高2~3cm時，打開培養瓶蓋，在室溫下煉苗7天后，將小苗移栽至珍珠巖:紅輝沸石＝1:1混合的基質中。
進一步的，步驟（2）所述培養基的優選為：MS +TDZ0.1 mg/L+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L。
更進一步的，步驟（2）所述培養基的優選為：MS +6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L。
本發明方法先從土當歸的葉片中誘導出愈傷組織，然后使其形成不定胚，再繼代增殖不定胚芽，通過循環培養分離成單個的不定胚，在固體培養基上培養成苗。
本發明的優點在于：選用配方合理的培養基，培養出的組培苗生根率高，穩定性好。該方法易操作，而且不受外界條件的限制，四季皆可進行，節約育苗占地面積，降低生產成本，不污染環境，可以實現批量生產。通過本發明方法生產土當歸，產量大，成本低，周期短，極具市場競爭力。本方法不僅取材方便，不會影響土當歸野生種群的數量；而且操作簡單、生產成本低、穩定高效，能大大縮短育苗周期，將為其保護和開發利用提供技術保障。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的內容作進一步說明，但并不是對本發明的限定。
實施例1
一種食用土當歸種苗的組織培養方法，包括如下步驟：
（1）外植體處理：取土當歸葉片為外植體，用清水洗去其表面的塵土，于70%酒精浸泡20-30s，無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，再用無菌水沖洗3~5次，最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分；
（2）外植體的初代培養：將處理后的外植體用解剖刀切成1.0 cm×1.0 cm的小塊，接種于MS +TDZ0.1 mg/L+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L， pH5.8的培養基中培養，培養溫度25±2℃，光照時間12h·d-1，光照強度2000~3000lx，21d時切口邊緣處即開始誘導出叢生小芽，誘導率為100%，培養50天統計增殖率，單個葉片誘導小苗數為20~30棵；
（3）繼代培養：將土當歸小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L， pH5.8的培養基中進行繼代培養，培養溫度25±2℃，光照時間12h·d-1，光照強度2000~3000lx，3天后小苗陸續誘導出根，繼續培養至40天長成健壯小苗，株高2-3cm，根的數目為8-20根；
（4）煉苗與移栽：待土當歸小苗株高2~3cm時，打開培養瓶蓋，在室溫下煉苗7天后進行移栽，花盆用50%多菌靈可濕粉劑1g/L溶液浸泡30min；將小苗用50%多菌靈可濕粉劑1000倍液浸泡整株小苗 10 分鐘，移栽入經高壓滅菌的珍珠巖和紅輝沸石體積比為1:1混合的基質中，30天后統計成活率，成活率為100%。
實施例2
一種食用土當歸種苗的組織培養方法，包括實施例1的方法步驟，與其不同的是：初代培養的外植體接種于MS+TDZ0.1 mg/L +6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L培養基中。13d時，葉片邊緣及外植體表面萌生大量細小芽點，芽在外植體上散在分布，芽健壯嫩綠，誘導率為66.7%。培養50天統計增殖率，單個葉片誘導小苗數為35~50棵。
實施例3
一種食用土當歸種苗的組織培養方法，包括實施例1的方法步驟，與其不同的是：初代培養的外植體接種于MS +6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L培養基中。19d時切口邊緣處即開始誘導出小芽，誘導率為100%。培養50天統計增殖率，單個葉片誘導小苗數為40~60棵。